Витамины вэжх мс что это такое

Высокоэффективная жидкостная хроматография с масс-спектрометрическим детектированием является одним из наиболее перспективных методов для идентификации и количественного определения лекарственных веществ в различных биологических объектах. Метод отличается высокой специфичностью, точностью и возможностью определения веществ в минимальных концентрациях, что позволяет использовать его для количественного определения лекарственных веществ при проведении фармакокинетических исследований и лекарственного мониторинга, что является значимым для клинической лабораторной диагностики. С этой целью необходима разработка и валидация методик количественного определения различных лекарственных веществ, в том числе инновационных, на основе ВЭЖХ-МС/МС-метода.

Оригинальным лекарственным веществом из группы нестероидных противовоспалительных средств является ацексазоламид – новое производное амида 1,3,4-тиадиазола и ацексамовой кислоты. Существенным преимуществом данного соединения является невысокая токсичность и низкая ульцерогенность [5, 6]. Для проведения фармакокинетических исследований и оценки биодоступности данного лекарственного вещества при различных путях введения необходима разработка надежной методики его количественного определения в биологических жидкостях.

Целью настоящего исследования явилась разработка методики идентификации и количественного определения нового нестероидного противовоспалительного средства из группы производных тиадиазола с помощью ВЭЖХ-МС/МС.

Материалы и методы

Объектом исследования явилось новое производное тиадиазола с лабораторным шифром ЛХТ_7-09, синтезированное в ОАО «ВНЦ БАВ» (г. Старая Купавна) проф. С.Я. Скачиловой (рис. 1).

2-(5-этил-1,3,4-тиадиазолил)амид 2-ацетиламиногексановой кислоты

Соединение ЛХТ_7-09 по внешнему виду представляет собой порошок белого цвета, который практически не растворим в воде, растворим в спирте, легко растворим в ацетонитриле.

Для идентификации и количественного определения ЛХТ_7-09 использовали валидированный метод высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектированием (ВЭЖХ-МС/МС).

Хроматографию осуществляли с помощью высокоэффективного жидкостного хроматографаAgilent 1260 InfinityII(AgilentTechnologies, ФРГ). В исследовании использовали аналитическую колонку AgilentPoroshell 120 EC-C18 2,7 мкм 2,1×10 мм. Для выделения исследуемого соединения нами был разработан градиентный режим хроматографии. В качестве элюента применяли ацетонитрил, воду деионизированную и аммония ацетат в различных соотношениях.

Для масс-спектрометрии использовали тройной квадрупольный масс-спектрометр ABSciexQTrap 3200 MD(ABSciex, Сингапур) с электрораспылительным источником ионов (TurboV с зондом TurboIonSpray). Калибровку масс-спектрометра проводили с помощью тестового раствора резерпина в концентрации 6,1×10 –2 мг/л.

Масс-спектрометрический анализ исследуемых образцов проводили в режиме электрораспыления при прямом вводе образца и элюата, подаваемого хроматографом. Прямой ввод исследуемых образцов в масс-хроматограф осуществляли с помощью шприцевого насоса диаметром 4,61 мм со скоростью 10 мкл/мин.

При разработке методики идентификации и количественного определения нового производного тиадиазола подбирали оптимальные условия высокоэффективной жидкостной хроматографии и масс-детектирования. Учитывали время выхода вещества из хроматографической колонки и MRM-переход (осуществляли регистрациюm/z иона-предшественника на первом аналитическом квадруполе Q1 и m/z ионов-продуктов на втором аналитическом квадруполе Q3). Для количественного определения ЛХТ_7-09 проводили построение калибровочного графика в диапазоне концентраций от 0,397 до 397 нг/мл.

В качестве программного обеспечения использовали AnalystMD 1.6.2.Software (ABSciex).

Результаты и обсуждение

На первом этапе экспериментального исследования осуществляли масс-детектирование исследуемого образца путем его прямого ввода в масс-детектор с помощью шприцевого насоса. На этапе пробоподготовки получали раствор ЛХТ_7-09(500 нг/мл) в смеси ацетонитрила и воды ионизированной в соотношении 2:1 с добавлением аммония ацетата (0,1%).

Предварительные эксперименты показали, что в режиме регистрации положительных ионов чувствительность определения ЛХТ_7-09 была выше, а масс-спектр интенсивнее и информативнее, чем в режиме регистрации отрицательных ионов. В связи с этим в дальнейших исследованиях использовали только режим положительной ионизации.

Для получения интенсивного пика были подобраны следующие условия масс-детектирования: положительная поляризация, напряжение электроспрея 5500,0 В, потенциал декластеризации и потенциал ввода – соответственно 36,0 и 6,5 В при давлении газа завесы 20,0 psi и газа распыления 40,0 psi, скорость 10 мкл/мин. Диапазон сканирования составлял 270–300 Да.

Анализ полученного масс-спектрана первом аналитическом квадруполе Q1 показал, что в данных условиях за счет присоединения протона водорода образуется протонированная молекула исследованного соединения [M+H] + со значением m/z285,2 Да (рис. 2).

Рис. 2. Масс-спектр протонированной молекулы ЛХТ_7-09(в режиме сканирования положительных ионов [M+H] + )

На втором аналитическом квадруполе Q3 осуществляли регистрацию ионов-продуктов для иона-предшественника со значением m/z285,2 Да. Анализ масс-спектра 2 порядка показал наличие множества пиков, из которых 3 были наиболее интенсивными – m/z 114,2 Дa, m/z 130,2 Дa и m/z 75,1 Дa (рис. 3).

Рис. 3. Масс-спектр ионов-продуктов (в режиме сканирования положительных ионов, ион-предшественник m/z 285,2 Да)

Для получения ионного сигнала высокой интенсивности были подобраны оптимальные значения энергии в ячейке соударения Q2 (рассмотрен диапазон энергий от 0 до 400 В). Для ионов-продуктов со значениями m/z114,2 Дa, 130,2 Дa и 75,1 Дaоптимальная энергия в соударительной ячейке составила соответственно 27 В; 23 В и 49 В.

Предполагается, что ион-продукт со значением m/z114,2 Дa является фрагментом 5-амино-2-этил-1,3,4-тиадиазола, так как при фрагментации других производных 1,3,4-тиадиазола также выявляется ион-продукт с таким же значением m/z. Ион-продукт со значением m/z 130,2 Да, вероятно, является протонированным фрагментом ацексамовой кислоты. Таким образом, результаты проведенного масс-детектирования исследуемого образца подтвердили химическую структуру нового производного 1,3,4-тиадиазола.

На следующем этапе экспериментального исследования осуществляли анализ исследуемого соединения методом ВЭЖХ-масс-спектрометрии.

В режиме ВЭЖХ-МС/МС использовали следующие условия ионизации: напряжение электроспрея 5500,0 В, скорость потока подвижной фазы 400 мкл/мин, температура азота 400 °С, давление газа завесы и распыляющего потока 20,0 и 50,0 psi соответственно. Скорость регистрации единичных масс-спектров составила 100 спектров в секунду. Для получения суммированного масс-спектра на хроматограмме выделяли временной промежуток 10,5–11,5 мин; по интенсивности сигнала ионов-продуктов строили кривые временной зависимости ионного тока и площади пиков отдельных сигналов, соответствующих исследуемому соединению. Объем вводимой пробы в аналитическую колонку составил 10 мкл.

Для выделения исследуемого соединения был использован градиентный режим высокоэффективной жидкостной хроматографии, который обеспечивался изменением состава элюента на входе в аналитическую колонку. В качестве элюента применяли ацетонитрил, воду деионизированную и аммония ацетат в различных соотношениях. Выбор градиентного режима хроматографии был связан с тем, что в условиях изократического режима элюирования (в том числе при использовании разных концентраций ацетонитрила) не удавалось получить пик исследуемого вещества симметричной формы с пригодным для анализа временем удерживания. По данным проведенного исследования оптимальным был следующий режим подачи элюента: с 0 до 4 мин концентрация ацетонитрила 1%; с 4 по 8 мин линейное увеличение концентрации ацетонитрила до 99 %; с 8 по 12 минуту – изократический участок (1% ацетонитрила). По завершении исследования осуществляли промывку хроматографической колонки 30 % раствором ацетонитрила в течение 5 минут.

При использовании описанного режима хроматографии для исследованного соединения был получен симметричный пик достаточной интенсивности (рис. 4).

Рис. 4. Хроматограмма ЛХТ _7-09 (аналитическая колонка Agilent Poroshell 120 EC-C18 2,7 мкм 2,1×10 мм; градиентный режим хроматографии)

Анализ полученных хроматограмм для растворов ЛХТ _7-09 разной концентрации показал, что время удерживания (tR) при данных условиях элюирования составило 11 минут и не зависело от концентрации исследуемого вещества. В связи с этим значение времени удерживания можно использовать в качестве дополнительного критерия подтверждения подлинности ЛХТ _7-09 в составе многокомпонентных смесей. Обращает на себя внимание тот факт, что данные параметры хроматографии можно использовать для идентификации ЛХТ _7-09 не только с помощью масс-детектора, но и других детекторов, в том числе фотометрического.

Для количественного определения нового производного тиадиазола осуществляли построение калибровочного графика в диапазоне концентраций от 0,397 нг/мл до 397 нг/мл (рис. 5).

Рис. 5. Калибровочный график для определения концентрацииЛХТ_7-09 (по оси абсцисс – концентрация ЛХТ_7-09 в нг/мл, по оси ординат – площадь пика в импульсах)

Для разработки градуировочного решения использовали растворы ЛХТ_7-09 в концентрациях 0,397; 1,980; 3,970; 19,8; 39,7; 198,0; 397,0 нг/мл. Зависимость площади пика от концентрации исследованного соединения описывалось следующим уравнением регрессии:

y= 8,9e 5 ·x 0,499 , значение коэффициента регрессии составило r=0,9936.

Следует отметить, что разработанное градуировочное решение позволяет с высокой точностью осуществлять количественное определение исследованного соединения в широком диапазоне концентраций, что позволяет использовать данный метод для оценки качества лекарственного вещества и для проведения фармакокинетических исследований.

Таким образом, результатом проведенного исследования явилась разработка метода идентификации и количественного определения нового аминокислотного производного тиадиазола с помощью ВЭЖХ-МС/МС.

Выводы

ВЭЖХ-МС/МС позволяет с высокой точностью осуществлять идентификацию и количественное определение нового аминокислотного производного тиадиазола.
Масс-детектирование нового производного тиадиазола ЛХТ _7-09 целесообразно проводить в режиме сканирования положительных ионов (МRM-переход – ион-предшественник Q1 m/z285,2 Да; ионы-продукты Q3m/z 114,2 Дa, m/z 130,2 Дa и m/z 75,1 Дa).
Для выделения ЛХТ _7-09 из многокомпонентных смесей разработана методика высокоэффективной жидкостной хроматографии (аналитическая колонка Agilent Poroshell 120 EC-C18 2,7 мкм 2,1×10 мм; элюент ацетонитрил: вода деионизированная: аммония ацетат; градиентный режим).

Источник

Витамин D, 25-гидрокси (кальциферол), ВЭЖХ-МС/МС

25-гидроксикальциферол – промежуточный продукт превращения витамина D, по уровню которого в крови можно судить о насыщенности организма кальциферолом и выявить дефицит или переизбыток витамина D. Исследование выполняется методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с тандемным масс-спектрометрическим детектированием (ВЭЖХ-МС/МС).

Витамин Д, 25-гидроксивитамин D, 25-гидроксикальциферол.

Vitamin D, 25-Hydroxy, 25-Hydroxycalciferol, 25-OH-D, Cholecalciferol Metabolite, Vitamin D3 Metabolite, calcidiol (25-hydroxy-vitamin D), calcifidiol (25-hydroxy-vitamin D), 25(OH)D.

Высокоэффективная жидкостная хроматография с тандемным масс-спектрометрическим детектированием (ВЭЖХ-МС/МС).

Нг/мл (нанограмм на миллилитр).

Какой биоматериал можно использовать для исследования?

Как правильно подготовиться к исследованию?

Детям в возрасте до 1 года не принимать пищу в течение 30-40 минут до исследования.
Детям в возрасте от 1 до 5 лет не принимать пищу в течение 2-3 часов до исследования.
Не принимать пищу в течение 2-3 часов до исследования, можно пить чистую негазированную воду.
Не курить в течение 30 минут до исследования.

Общая информация об исследовании

Витамин D – жирорастворимое вещество, необходимое для поддержания в крови уровня кальция, фосфора и магния. По своему действию он является гормоном и антирахитическим фактором. Существует несколько форм витамина D, которые можно определить в крови: 25-гидроксивитамин D [25(OH)D] и 1,25-дигидроксивитамин D [1,25(OH)(2)D]. 25-гидроксивитамин D – основная неактивная форма гормона, содержащегося в крови, предшественник активного гормона 1,25-дигидроксивитамина D. Для определения количества витамина D обычно используется 25-гидроксивитамин D из-за его высокой концентрации и длительного периода полураспада.

По происхождению витамин D бывает двух типов: эндогенный (холекальциферол), который образуется в коже под влиянием солнечных лучей, и экзогеннный (эргокальциферол), который поступает в организм вместе с пищей. Пищевые источники витамина D: жирная рыба (например, лосось, скумбрия), рыбий жир. В основном витамин D является продуктом превращения 7-дегидрохолестерола, образующегося в коже под воздействием ультрафиолетового излучения с длиной волны 290-315 нм. Синтез витамина D зависит от длительности воздействия и интенсивности излучения. Переизбытка кальциферола при этом не возникает, так как существуют фоточувствительные защитные механизмы, которые метаболизируют лишний витамин D в тахистерол и люмистерол. В печени витамин D превращается в 25-гидроксикальциферол, который и является основным лабораторным показателем уровня витамина D в организме. В крови данная форма витамина транспортируется в комплексе с белком. В почках 25-ОН-D превращается в биологически активную форму витамина D – 1,25-дигидроксикальциферол (1,25-ОН(2)-D), который стимулирует всасывание кальция в кишечнике и реабсорбцию кальция и фосфора в почках.

При дефиците витамина D уровень кальция компенсируется за счет его мобилизации из костной ткани, что может привести к остеомаляции, рахиту у детей и остеопорозу у взрослых. По данным некоторых исследований, дефицит витамина D также ассоциирован с аутоиммунными заболеваниями, раком простаты, раком молочных желез, раком толстой кишки, гипертонией, заболеваниями сердца, множественным склерозом, сахарным диабетом 1-го типа. Риск развития дефицита витамина D высокий у людей с нарушениями всасывания питательных веществ в кишечнике (например, при болезни Крона, внешнесекреточной недостаточности поджелудочной железы, муковисцидозе, целиакии, состояний после резекции желудка и кишечника), заболеваниями печени, нефротическим синдромом. Пожилые люди, жители северных широт и люди, избегающие солнечного света, также страдают недостатком витамина D. Поэтому нередко детям и взрослым с риском дефицита витамина D назначают препараты с эрго- или холекальциферолом.

Однако чрезмерное употребление препаратов витамина D имеет негативные последствия. Его избыток токсичен, может вызвать тошноту, рвоту, задержку роста и развития, повреждение почек, нарушение обмена кальция и работы иммунной системы. В связи с этим важен контроль уровня витамина D в крови, своевременная диагностика его дефицита или переизбытка.

Для чего используется исследование?

Для диагностики дефицита или избытка витамина D.
Для выявления причин нарушения обмена кальция, патологии костной ткани.
Для контроля за эффективностью лечения препаратами витамина D и коррекции дозы.

Когда назначается исследование?

При симптомах дефицита витамина D, таких как искривление костей у детей (рахит) и слабость, размягчение и ломкость костей у взрослых (остеомаляция).
При комплексной диагностике кальциевого обмена.
При низком уровне кальция в крови и изменении уровня паратгормона.
Перед началом лечения остеопороза (некоторые современные лекарства от остеопороза содержат рекомендованную дозу витамина D).
При синдроме мальабсорбции (на фоне муковисцидоза, болезни Крона, целиакии).
Во время лечения препаратами, содержащими витамин D.

Что означают результаты?

Референсные значения: 20 — 65 нг/мл.

Причины пониженного уровня 25-гидроксивитамина D:

нехватка солнечного света;
недостаточное потребление витамина D с пищей;
нарушение всасывания витамина D из кишечника при синдроме мальабсорбции;
нефротический синдром (в связи с повышенной потерей жидкости и белка);
заболевания печени (нарушение одного из этапов метаболизма витамина D);
прием некоторых лекарственных препаратов (например, фенитоина, который влияет на способность печени производить 25-гидроксивитамин D).

Повышенный уровень 25-гидроксивитамина D:

чрезмерное употребление препаратов, содержащих витамин D.

Что может влиять на результат?

Лекарственные препараты, снижающие уровень 25-гидроксикальциферола в крови: фенитоин, фенобарбитал, рифампицин, пероральные антикоагулянты.
Беременность.

Высокие концентрации витамина D и кальция могут привести к кальцинозу и повреждению органов, особенно почек и кровеносных сосудов.
Уровни витамина D, кальция, фосфора и паратиреоидного гормона тесно связаны. Так, при избытке витамина D и кальция снижается синтез паратгормона.
Во время беременности метаболизм витамина D контролируется пролактином и соматотропным гормоном.

Кто назначает исследование?

Педиатр, терапевт, ортопед, травматолог, ревматолог, эндокринолог.

Источник