Витамин в12 методика определения
Принцип определения витамина В12 в сыворотке. L. leishmanii это микроорганизм, несплособный синтезировать витамин В12. Если в подопытную среду, лишенную витамина В12, в которой добавлена проба сыворотки, ввести эту лактобациллу, то рост ее (измеренный турбидиметрическим способом) пропорционален количеству витамина В12, содержащегося в исследуемом материале.
Материалы для определения витамина В12 в сыворотке с помощью Lactobacillus leishmanii. Микроорганизмы для испытания: Lactobacillus leishmanii (N.C.I.В. 7884).
а) Раствор А, в состав которого входят: кислый гидролизат казеина, в достаточном количестве для 2,7 г. общего азота; 10 г. гидрированного уксуснокислого натрия (или 6 г. ангидрного); 2,5 г. КН2Р04; 2,5 г. К2НР04; 100 мг триптофана; 100 мг. гидрохлористого цистеина; 10 мг. аденина; 10 мг. гуанина; 10 мг. урацила; 10 мг. ксантина; 20 мл солевого раствора Б; до 400 мл дистилированной воды.
Кислый гидролизат казеина и соли перемешать с частью дистилированной воды, подогреть до 70°С и отфильтровать. Далее добавить отмеченные количества триптофана, цистеина и аденина (предварительно растворенные в небольшом количестве .N-раствора НО), затем гуанина, урацила и ксантина (растворенные в небольшом количестве B-раствора NaOH). Дополнить дистилированной водой до 400 мл.
б) Раствор Б (солей) состоит из: 10 г. MgS04. 7H20; 0,7 г амииачного железистого сульфата; 2 г. MnS04.4H20; 1 мл концентрированной соляной кислоты; до 250 мл дистилированной воды.
в) Раствор В (с витаминами), образованный из: 5 мг. гидрохлористого анеурина; 10 мг. пиридоксина; 5 мг, пиридоксала; 5 мг пиридоксамина; 1 мг парааминобензоиной кислоты; 5 мг рибофлавина; 5 мг. никотиновой кислоты; 5 мг. пантотената кальция; 5 мг птероилглютамовой кислоты; 20 мл дистилированной воды. (Раствор запечатывается в ампулы, вместимостью 1 мл, которые хранятся на холоде).
г) Полная основная среда (концентрации 5/3 от конечной концентрации) в достаточном количестве для 5 проб (дополнительно нормальная сыворотка и стандартные растворы) состоит из: 200 мл раствора А; 1 мл раствора В (с витаминами); 10 г глюкозы; 250 мг тиомаликовой кислоты; 62,5 мг натриевой соли гуанилиновой кислоты; 0,5 мл Tween 80; 0,5 г фенобарбитурата натрия; 2 мл раствора биотина из расчета 1 мкг/мл; до 300 мл дистилированной воды. (Глюкозу, гуаниловую кислоту и фенобарбитурат натрия развести в дистилированной воде и влить в смесь, перед дополнением объема до 300 мл).
д) Витамин В12 в виде раствора из расчета 50 мкг/мл (для приготовления стандартных растворов). Вымерить точно 1 мл (шприцем для туберкулина), налить в градуированный баллон вместимостью 50 мл хранить в рефриясераторе до 3 месяцев.
е) Раствор цианида натрия + буфер-ацетат (для испытания сыворотки). Приготовление: 20 мл 0,1% раствора NaCN, 50 мл буфера-ацетат натрия 0,4 М, с показателем водорода 4,5 и до 1000 мл дистилированной воды.
ж) Лабораторная посуда: пробирки 150 х 16 мм с алюминиевыми крышками; градуированная колба на 50 мл; 6 градуированных колб, на 20 мл каждая; 2 градуированные пипекти, по 5 мл; 2 градуированные липетки по 1 мл; 2 микропипетки по 0,1 мл; градуированные цилиндры, на 500, 250 и 50 мл; большая пробирка; колбы Эрленмайерана 500 и 200 мл.
Приобрести новую стеклянную посуду, исходно обработать ее на теплоте 10% азотной кислотой, хорошо прополоскать дистилированной водой и хранить лишь для определения витамина В12 (также материалы, используемые для чистки посуды); алюминиевые крышки прокипятить в воде с детергентом, затем прополоскать дистилированной водой; между двумя определениями, чистить лишь кипячением и полосканием.
Техника определения витамина В12 в сыворотке с помощью Lactobacillus leishmanii
1) Приготовление проб для испытания: отобрать у больного, без противосвертывающего вещества, количество крови (примерно 5—10 мл), с расчетом получения 2 мл сыворотки; осветлить после ретракции сгустка; когда определение проводится позже, сыворотку сохранять замороженной (при —20°С).
2) Подготовка предназначенного к исследованию микроорганизма. Исходно культуру микроорганизма проводить на 5 мл простой концентрированной основной среде, к которой добавить 1% растворимого протеолизата печени; после однодневной инкубации (18 ч) процентрифугировать, осветлить надосадочную массу; повторную взвесь бактериального осадка в оставшейся среде слить в стерильные ампулы, для образования запаса.
Культуры, предназначенные для определения, проводить на твердой среде, приготовленной из среды с протеолизатом печени и 1% агара (преимущество твердой среды заключается в том, что делает возможным контроль чистоты).
Приготовление материала для инъецирования. С твердой среды одну колонию впрыскнуть в 5 мл жидкой среды с протеолизатом печени; после 18-часовой инкубации процентрифугировать, осветлить надосадочную массу, осадок, трижды промыть стерильной дистилированной водой и образовать повторную суспензию в 5 мл стерильной дистилированной воды; 0,1 мл этой взвеси ввести в 5 мл простой концентрированной основной среды и оставить 18 часов для аэробной инкубации; далее из этой нераз-веденной культуры повторно ввести по 0,1 мл в два участка по 5 мл той же среды и еще раз подвергнуть 6-ти часовой инкубации. Таким способом получим однородный препарат для инъецирования с одинаковым вырастанием.
3) Техника испытания. По окончании приготовления полной основной среды (концентрация 5/3) приступить к приготовлению сывороточных экстрактов. Для этого, с помощью градуированной пипетки отметить 1 (или 2) мл сыворотки; из крупной пипетки добавить 19 (или 18) мл раствора цианида натрия + буфера-ацетат (получим разведение 1:20 или 1:10); заложить в автоклав на 30 мин., при давлении 2 атмосфер.
Приготовление стандартных растворов витамина В12. В целях получения стандартных растворов концентрации 25, 50, 100, 200, 400, 800 пг/мл развести 1 мл витамина В12 50 мкг/мл в дистилированной воде из расчета 1:50 (в градуированной колбе на 50 мл), затем в шесть градуированных колб на 20 мл каждая влить 0,5, 1, 2, 4, 8 и 16 мл и дополнить дистилированной водой. Далее по 1 мл этих растворов обработать подобно сывороточным пробам.
Приготовление пробирок для испытания. Набор проб слагается из 5 сывороточных проб для испытания, одной сывороточной нормальной (контрольной) и 6 стандартных растворов витамина В12. Определения проводить в двух экземплярах.
С помощью крупной пипетки влить в каждую пробирку по 15 мл основной среды (5/3), заложить в автоклав на 6 мин. при давлении 4 атмосфер; добавить по 10 мл автоклавированной сыворотки или стандартного раствора витамина В12, а затем по 0,5 мл приготовленного в течение 6 часов материала для инъецирования; хорошо взболтать для гомогенизации. В четыре стерильные пробирки влить (стерильными пипетками) по 15 мл инъецированной среды (без материала, содержащего витамин В12), в качестве контрольного препарата на стерильность.
Инкубацию провести в посуде для вакуума, из которой удаляется воздух (с помощью насоса для вакуума) и вводится водород. Этот метод обеспечивает более однородное и одинаковое развитие; продолжительность инкубации 36 часов.
Определение развития бактерий осуществляется турбидиметром с нефелометром (возможно фотометрическим путем), результаты получаются интерполяцией на стандартной кривой, построенной по значениям стандартных растворов В12.
Толкование результатов определения витамина В12 в сыворотке с помощью Lactobacillus leishmanii
Проще и быстрее прочих микробиологических способов метод, использующий L. leishmanii дает близкие к ним результаты, с хорошим воспроизведением. Нормальные значения колеблятся от 200 до 900 пг/мл.
При недостатке витамина В12 значения меньше 100 пг/мл, в то время как высокие наблюдаются у страдающих хронической гранулоцитной лейкемией (до нескольких тысяч пг/мл), после инъецирования В12, а иногда при отдельных заболеваниях печени. Метод не применять больным, проходящим курс лечения антибиотиками (угнетающими развитие микроорганизма).
Редактор: Искандер Милевски. Дата обновления публикации: 18.3.2021
Источник
Витамин в12 методика определения
Витамин В 12 и фолаты являются необходимыми компонентами при синтезе ДНК. Поэтому дефицит этих витаминов может вызывать нарушения в продукции, созревании и функциональном состоянии эритроцитов и лейкоцитов, вызывая мегалобластную анемию, с одной стороны, и изменения в нейропсихологических реакциях, с другой, причем последние могут проявляться независимо от наличия анемии. Витамин В12 синтезируется только микроорганизмами и поступает в организм человека и животных с мясной пищей. За всасывание витамина В12 ответственен внутренний “intrinsic” фактор в пищеварительном тракте. При его дефиците или отсутствии возникает пернициозная анемия. Источником фолатов являются овощи, фрукты и печень.
Структурно витамин В12 относится к кобаламинам, в состав которых входит корриновое кольцо, в центре которого находится атом кобальта, верхний лиганд, ковалентно связанный с кобальтом, и нуклеотидная боковая цепь. Фолиевая кислота относится к птероглютаминовым кислотам. Как витамин В12, так и фолаты имеют много дериватов. Среди известных витаминов кобаламины занимают первое место по структурной сложности и разнообразию, а по концентрации в организме — последнее. Однако, реакции, в которых они принимают участие, крайне важны для нормального метаболизма животных организмов. Это, прежде всего, реакция переноса метильных групп на гомоцистеин и участие в синтезе метионинсинтетазы, которая является одним из звеньев в каскаде реакций, ответственных за проведение нервных импульсов, а также реакция мутазного типа по превращению метилмеланила-КоА в сукцинил-КоА — ключевой стадии в метаболитических, и синтетических реакциях.
В связи с вышеуказанным, количественное определение витамина В12 и фолатов существенно как для гематологии, так и неврологии при проведения дифференциальной диагностики, назначении адекватной терапии и динамических наблюдений.
Поскольку содержание кобаламинов и фолатов в организме крайне незначительно, определение их возможно только современными высокочувствительными методами — радиоиммунными, энзимоиммунными и иммунофлюоресцентными. Большинство наборов, выпускаемых фирмами в данное время, приспособлено для автоматизированных “закрытых” систем и очень дороги, поэтому разработка относительно недорогого иммуноферментного метода, приспособленного для “открытой” системы, является весьма актуальной проблемой.
Мы решили применить твердофазный иммуноферментный метод, используя моноклональные антитела против витамина В12 и фолиевой кислоты производства фирмы Sigma.
Поскольку как витамин В12, так и фолаты являются гаптенами, для проведения иммуноэнзимного анализа требовалось получение конъюгатов этих соединений с бычьим сывороточным альбумином.
Получение конъюгатов проводили карбодиимидным методом. Для конъюгата витамина В12 использовали его карбоксильное производное, любезно предоставленное нам Рудаковой И.П., а для фолатов — фолиевую кислоту. Ниже мы приводим описание метода по получению конъюгатой Альб-В12 и Альб-фолат.
10 мг фолиевой кислоты (17,6мкмоль) и 10 мг карбоксилатного производного цианкобаламина (7 мкмоль) растворяли каждый в 2 мл абсолютного диметилформамида, и добавляли по 2 мг дициклогексилкарбодиимида(10 мкмоль) и по 5 мг N-гидроксисукцинимида(43 мкмоль). Реакционную смесь инкубировали в темноте в течение 3-х суток в случае фолиевой кислоты и 2-х — витамина В12 до выпадения кристаллов дициклогексилмочевины. Затем супернатант, содержащий N-гидроксисукцинимидилфолат добавляли к 20 мл раствора БСА (2,5мг/мл), а супернатант с N-гидрокси-сукцинимидилкобаламином — к 6,5 мл раствора БСА(10 мг/мл) в 0,1 М карбонатном буфере, рН 9,2. Реакцию конъюгирования проводили в течение 6 часов при комнатной температуре в темноте, после чего конъюгат диализовали в темноте при 4 ° С против 0,01М трис-хлоридного буфера, рН 7,2, содержащего 0,15М хлорида натрия для удаления несвязавшихся продуктов реакции( соответственно фолиевой кислоты и цианкобаламина). Степень модификации БСА фолиевой кислотой определяли спектрофотометрически, используя молярный коэффициент экстинкций 29100 М -1 см -1 при длине волны 297 нм. Она составляла 3 остатка на моль белка. Степень модификации БСА цианкобаламином определяли также спектрофотометрически, используя коэффициент экстинкции 8700 М -1 см -1 при l =550 нм. В нашем случае она составила 0,3 моля на моль белка.
Твердофазным носителем служили иммунологические планшеты фирмы Nunk, которые были сенсибилизированы растворами конъюгатов. Стандартные растворы получали из конъюгатов Альб-В12 и Альб-фолат, определяя их концентрацию спектрофотометрически, как указано выше. В данных системах был применен непрямой конкурентный метод иммуноферментного анализа с использованием моноклональных антител против витамина В12 и фолиевой кислоты. Количество связавшихся антител определяли, используя конъюгат анти-IgG человека с пероксидазой хрена /анти-IgG-ПХ/, по его связыванию с твердой фазой. Субстратом реакции служил ТМВ.
Была проведена работа по подбору эквивалентных концентраций всех реагентов, участвующих в реакции.
Ниже мы приводим условия постановки реакции с указанием подобранных разведений для всех реагентов.
Сенсибилизацию планшетов проводили конъюгатами Альб-В12 и Альб-фолат в разведении 1:20 в фосфатном буфере с БСА /ФБС/ в течение первых 3-х часов при 37 0 С, а затем в течение ночи в холодильнике. Затем планшеты были отмыты несколько раз ФСБ. Антигены, т.е. стандартные растворы и испытуемые образцы, предварительно прогревали при 100 0 С в растворе 0,3N NaOH с KCN и с дитиотретолом/ДТТ/ для перевода всех дериватов кобаламинов и фолатов в циан-форму и предотвращения денатурации при кипячении. Использовали следующие концентрации стандартных растворов: 1300 пг/мл, 650 пг/мл, 300 пг/мл, 150 пг/мл и 75 пг/мл — для витамина В12 и 20нг/мл, 10нг/мл, 5нг/мл и 2,5нг/мл — для фолатов.
Стандартные растворы и испытуемые образцы — 0,1 мл — помещали в специальные пробирки и добавляли по 0,1 мл раствора NaOH(0,3 N) c KCN(1мг/мл) и ДТТ (50мкл ДТТ на 6 мл раствора щелочи). Пробирки закрывали крышечками из фольги и помещали на 10 мин в кипящую водяную баню. Затем все пробы охлаждали и вносили по 0,1 мл в сенсибилизированные планшеты. Реакцию проводили в течение 12-14 часов при 4-6 0 , после чего планшеты снова отмывали, а затем вносили соответственно по 0,1 мл антител против витамина В12 в разведении 1:1000 и 0,1 мл антител против фолиевой кислоты в разведении 1:500. Планшеты снова помещали в холодильник на 12-14 часов, после чего их в очередной раз отмывали ФСБ. Затем во все лунки планшета вносили по 0,1 мл анти-IgG-ПХ в разведении 1:10000 и помещали в термостат на 2 часа, снова отмывали ФСБ и затем добавляли по 0,1 мл ТМВ, а после развития окраски через 10-15 мин реакцию закрепляли 4% H 2 SO 4 . Результаты спектрофотометрировали на приборе Titertek Multiskan при l 450 nm. На основании стандартных разведений строили кривую, по которой затем определяли концентрации исследуемых соединений в испытуемых образцах.
Ниже приведены стандартные кривые, полученные при использовании разработанного нами метода. Для проверки набора мы использовали также фирменные стандартные разведения, любезно предоставленные нам Деминой Д.Г. Кривая с фирменными разведениями аналогична кривой с нашими реактивами (рис.1,2).
Проверка набора по контрольным сывороткам также дала положительные результаты: в сыворотке с содержанием витамина В12 900- 1000 пг/мл получено значение 1200 пг/мл, а в сыворотке с уровнем В12 200-250 пг/мл мы получили 180 пг/мл. Подобная сходимость была получена и в отношении определения фолатов: при 16-20нг/мл — 18,5нг/мл, а при 2-4нг/мл — 3,5нг/мл. Кроме того, в нескольких образцах сыворотки определение витамина В12 было проведено нами и в центральном диагностическом центре. Результаты были сходными: 1070 пг/мл — в диагностическом центре и 1200 пг/мл у нас, 250 пг/мл в диагностическом центре и 225 пг/мл с нашим набором.
Всего определение витамина В12 и фолиевой кислоты было проведено в образцах крови 25-ти доноров и 250-ти больных с различными видами анемий. Средние значения витамина В12 в норме составило 700 ± 150 пг/мл (350-900), среднее значение фолиевой кислоты — 7,5 ± 2,3 нг/мл(5,8-10), что соответствует литературным данным.
У больных с железодефицитной анемией /ЖДА/ до лечения уровень витамина В12 составлял 926 ± 205,5 пг/мл, а после проведения ферротерапии при нормализации уровня Нв снизился до 276 ± 49,9 пг/мл Уровень фолатов до терапии был 15,6 ± 5,3 нг/мл, а после терапии — 9,0 ± 2,2 нг/мл. Данные результаты вполне логичны, поскольку эти витамины потребляются при синтезе гемоглобина. У больных с лимфопролиферативными заболеваниями наблюдались повышенные значения витамина В12, в отдельных случаях даже до 2000 пг/мл и пониженное содержание фолатов — до 2,5 нг/мл. У больных с миелопролиферациями отмечено понижение как витамина В12, так и фолиевой кислоты. Полученные нами результаты согласуются с литературными данными.
Таким образом, разработанная нами система для определения витамина В12 и фолатов на основе “открытого” иммуноферментного метода может быть использована при диагностике и динамическом лечении различных форм анемий.
Источник