Витамин в12 метод определения

Принцип определения витамина В12 в сыворотке. L. leishmanii это микроорганизм, несплособный синтезировать витамин В12. Если в подопытную среду, лишенную витамина В12, в которой добавлена проба сыворотки, ввести эту лактобациллу, то рост ее (измеренный турбидиметрическим способом) пропорционален количеству витамина В12, содержащегося в исследуемом материале.

Материалы для определения витамина В12 в сыворотке с помощью Lactobacillus leishmanii. Микроорганизмы для испытания: Lactobacillus leishmanii (N.C.I.В. 7884).

а) Раствор А, в состав которого входят: кислый гидролизат казеина, в достаточном количестве для 2,7 г. общего азота; 10 г. гидрированного уксуснокислого натрия (или 6 г. ангидрного); 2,5 г. КН2Р04; 2,5 г. К2НР04; 100 мг триптофана; 100 мг. гидрохлористого цистеина; 10 мг. аденина; 10 мг. гуанина; 10 мг. урацила; 10 мг. ксантина; 20 мл солевого раствора Б; до 400 мл дистилированной воды.

Кислый гидролизат казеина и соли перемешать с частью дистилированной воды, подогреть до 70°С и отфильтровать. Далее добавить отмеченные количества триптофана, цистеина и аденина (предварительно растворенные в небольшом количестве .N-раствора НО), затем гуанина, урацила и ксантина (растворенные в небольшом количестве B-раствора NaOH). Дополнить дистилированной водой до 400 мл.

б) Раствор Б (солей) состоит из: 10 г. MgS04. 7H20; 0,7 г амииачного железистого сульфата; 2 г. MnS04.4H20; 1 мл концентрированной соляной кислоты; до 250 мл дистилированной воды.

в) Раствор В (с витаминами), образованный из: 5 мг. гидрохлористого анеурина; 10 мг. пиридоксина; 5 мг, пиридоксала; 5 мг пиридоксамина; 1 мг парааминобензоиной кислоты; 5 мг рибофлавина; 5 мг. никотиновой кислоты; 5 мг. пантотената кальция; 5 мг птероилглютамовой кислоты; 20 мл дистилированной воды. (Раствор запечатывается в ампулы, вместимостью 1 мл, которые хранятся на холоде).

г) Полная основная среда (концентрации 5/3 от конечной концентрации) в достаточном количестве для 5 проб (дополнительно нормальная сыворотка и стандартные растворы) состоит из: 200 мл раствора А; 1 мл раствора В (с витаминами); 10 г глюкозы; 250 мг тиомаликовой кислоты; 62,5 мг натриевой соли гуанилиновой кислоты; 0,5 мл Tween 80; 0,5 г фенобарбитурата натрия; 2 мл раствора биотина из расчета 1 мкг/мл; до 300 мл дистилированной воды. (Глюкозу, гуаниловую кислоту и фенобарбитурат натрия развести в дистилированной воде и влить в смесь, перед дополнением объема до 300 мл).

д) Витамин В12 в виде раствора из расчета 50 мкг/мл (для приготовления стандартных растворов). Вымерить точно 1 мл (шприцем для туберкулина), налить в градуированный баллон вместимостью 50 мл хранить в рефриясераторе до 3 месяцев.

е) Раствор цианида натрия + буфер-ацетат (для испытания сыворотки). Приготовление: 20 мл 0,1% раствора NaCN, 50 мл буфера-ацетат натрия 0,4 М, с показателем водорода 4,5 и до 1000 мл дистилированной воды.

ж) Лабораторная посуда: пробирки 150 х 16 мм с алюминиевыми крышками; градуированная колба на 50 мл; 6 градуированных колб, на 20 мл каждая; 2 градуированные пипекти, по 5 мл; 2 градуированные липетки по 1 мл; 2 микропипетки по 0,1 мл; градуированные цилиндры, на 500, 250 и 50 мл; большая пробирка; колбы Эрленмайерана 500 и 200 мл.

Приобрести новую стеклянную посуду, исходно обработать ее на теплоте 10% азотной кислотой, хорошо прополоскать дистилированной водой и хранить лишь для определения витамина В12 (также материалы, используемые для чистки посуды); алюминиевые крышки прокипятить в воде с детергентом, затем прополоскать дистилированной водой; между двумя определениями, чистить лишь кипячением и полосканием.

Техника определения витамина В12 в сыворотке с помощью Lactobacillus leishmanii

1) Приготовление проб для испытания: отобрать у больного, без противосвертывающего вещества, количество крови (примерно 5—10 мл), с расчетом получения 2 мл сыворотки; осветлить после ретракции сгустка; когда определение проводится позже, сыворотку сохранять замороженной (при —20°С).

2) Подготовка предназначенного к исследованию микроорганизма. Исходно культуру микроорганизма проводить на 5 мл простой концентрированной основной среде, к которой добавить 1% растворимого протеолизата печени; после однодневной инкубации (18 ч) процентрифугировать, осветлить надосадочную массу; повторную взвесь бактериального осадка в оставшейся среде слить в стерильные ампулы, для образования запаса.
Культуры, предназначенные для определения, проводить на твердой среде, приготовленной из среды с протеолизатом печени и 1% агара (преимущество твердой среды заключается в том, что делает возможным контроль чистоты).

Приготовление материала для инъецирования. С твердой среды одну колонию впрыскнуть в 5 мл жидкой среды с протеолизатом печени; после 18-часовой инкубации процентрифугировать, осветлить надосадочную массу, осадок, трижды промыть стерильной дистилированной водой и образовать повторную суспензию в 5 мл стерильной дистилированной воды; 0,1 мл этой взвеси ввести в 5 мл простой концентрированной основной среды и оставить 18 часов для аэробной инкубации; далее из этой нераз-веденной культуры повторно ввести по 0,1 мл в два участка по 5 мл той же среды и еще раз подвергнуть 6-ти часовой инкубации. Таким способом получим однородный препарат для инъецирования с одинаковым вырастанием.

3) Техника испытания. По окончании приготовления полной основной среды (концентрация 5/3) приступить к приготовлению сывороточных экстрактов. Для этого, с помощью градуированной пипетки отметить 1 (или 2) мл сыворотки; из крупной пипетки добавить 19 (или 18) мл раствора цианида натрия + буфера-ацетат (получим разведение 1:20 или 1:10); заложить в автоклав на 30 мин., при давлении 2 атмосфер.

Приготовление стандартных растворов витамина В12. В целях получения стандартных растворов концентрации 25, 50, 100, 200, 400, 800 пг/мл развести 1 мл витамина В12 50 мкг/мл в дистилированной воде из расчета 1:50 (в градуированной колбе на 50 мл), затем в шесть градуированных колб на 20 мл каждая влить 0,5, 1, 2, 4, 8 и 16 мл и дополнить дистилированной водой. Далее по 1 мл этих растворов обработать подобно сывороточным пробам.

Приготовление пробирок для испытания. Набор проб слагается из 5 сывороточных проб для испытания, одной сывороточной нормальной (контрольной) и 6 стандартных растворов витамина В12. Определения проводить в двух экземплярах.

С помощью крупной пипетки влить в каждую пробирку по 15 мл основной среды (5/3), заложить в автоклав на 6 мин. при давлении 4 атмосфер; добавить по 10 мл автоклавированной сыворотки или стандартного раствора витамина В12, а затем по 0,5 мл приготовленного в течение 6 часов материала для инъецирования; хорошо взболтать для гомогенизации. В четыре стерильные пробирки влить (стерильными пипетками) по 15 мл инъецированной среды (без материала, содержащего витамин В12), в качестве контрольного препарата на стерильность.

Инкубацию провести в посуде для вакуума, из которой удаляется воздух (с помощью насоса для вакуума) и вводится водород. Этот метод обеспечивает более однородное и одинаковое развитие; продолжительность инкубации 36 часов.

Определение развития бактерий осуществляется турбидиметром с нефелометром (возможно фотометрическим путем), результаты получаются интерполяцией на стандартной кривой, построенной по значениям стандартных растворов В12.

Толкование результатов определения витамина В12 в сыворотке с помощью Lactobacillus leishmanii

Проще и быстрее прочих микробиологических способов метод, использующий L. leishmanii дает близкие к ним результаты, с хорошим воспроизведением. Нормальные значения колеблятся от 200 до 900 пг/мл.

При недостатке витамина В12 значения меньше 100 пг/мл, в то время как высокие наблюдаются у страдающих хронической гранулоцитной лейкемией (до нескольких тысяч пг/мл), после инъецирования В12, а иногда при отдельных заболеваниях печени. Метод не применять больным, проходящим курс лечения антибиотиками (угнетающими развитие микроорганизма).

Редактор: Искандер Милевски. Дата обновления публикации: 18.3.2021

Источник

Витамин В12, активный (холотранскобаламин)

Витамин В12 (цианокобаламин) – это водорастворимый витамин, который играет важную роль в нормальном функционировании нервной системы и формировании клеток крови. Его дефицит может вызвать серьезные изменения в организме. Кобаламин в сыворотке крови связан с двумя белками, транскобаламином (TК) и гаптокоррином (ГК). Комплекс транскобаламин — кобаламин называется холотранскобаламином (ХолоТК), или активным B12. Более значительная фракция (около 80 %) кобаламина, переносимая ГК (ХолоГК), считается метаболически неактивной, так как только в печени имеются клеточные рецепторы к ней. Активный B12 содержит биологически доступный кобаламин, так как только связанный транскобаламином B12 обеспечивает доступ кобаламина во все клетки через специфические рецепторы. Из-за более короткого периода полувыведения активного B12, чем у ХолоГК, снижение уровня активного B12 является одним из самых ранних маркеров дефицита кобаламина.

Тест на витамин В12, активный (ХолоТК) может применяться как вторичный, после определения общего уровня B12, или как основной.

Диапазон определения: 5,0 — 256,0 пмоль/л.

Пмоль/л (пикомоль на литр).

Какой биоматериал можно использовать для исследования?

Как правильно подготовиться к исследованию?

Не принимать пищу в течение 4 часов до исследования, можно пить чистую негазированную воду.
Детям в возрасте до 1 года не принимать пищу в течение 30-40 минут до исследования.
Детям в возрасте от 1 до 5 лет не принимать пищу в течение 2-3 часов до исследования.
Исключить физическое и эмоциональное перенапряжение в течение 30 минут до исследования.
Не курить в течение 30 минут до исследования.

Общая информация об исследовании

Витамин B12 (кобаламин) в сыворотке крови связан с двумя белками: транскобаламином (ТК) и гаптокоррином (ГК). Комплекс транскобаламин — витамин B12 называется холотранскобаламином (ХолоТК). ХолоТК содержит биологически доступный кобаламин, так как только он обеспечивает поступление кобаламина во все клетки через специальные рецепторы. Для сравнения: приблизительно 80 % кобаламина, переносимого HC, считается метаболически неактивными, потому что не существует специальных рецепторов клетки, кроме рецепторов в
печени. Генетическое отсутствие HC встречается редко и не рассматривается как серьезное состояние, о днако генетическое отсутствие или отклонения от нормы TC обычно свидетельствуют о гематологических, неврологических и метаболических патологиях дефицита кобаламина, требующих интенсивной терапии, даже если результаты анализа сыворотки крови показывают нормальные концентрации кобаламина.

Более короткий период полураспада циркулирующего ХолоТК по сравнению с периодом полураспада хологаптокоррина (ХолоГК) делает снижение уровня ХолоТК одним из самых ранних маркеров дефицита кобаламина. Измерения уровня общего кобаламина в сыворотке крови имеют ряд ограничений, в частности большая часть измеряемого кобаламина связана с ГК. В ряде опубликованных исследований утверждается, что ХолоТК является лучшим индикатором статуса витамина B12, чем общий кобаламин в сыворотке крови. Были разработаны методики на основе специфических антител к антиTC, подтверждающие полезность ХолоТК в диагностике дефицита B12. Как и предполагалось, у пациентов с биохимическими признаками дефицита витамина B12 уровни ХолоТК низкие. В частности, сообщалось
о низких значениях у вегетарианцев, веганов и у населения с низким потреблением витамина B12. Кроме того, сообщалось о более низких уровнях ХолоТК (но не витамина B12) в сыворотке крови у пациентов с синдромом Альцгеймера по сравнению с уровнями ХолоТК у контрольной группы здоровых людей. Уровни ХолоТК являются отражением статуса витамина B12, независимым от недавнего потребления витамина.

Для чего используется исследование?

Определение холотранскобаламина в сыворотке крови в рамках диагностики и лечения дефицита витамина B12; как ранний маркер дефицита кобаламина.

Когда назначается исследование?

Как вторичное тестирование — при риске дефицита B12:
- вероятность дефицита — B12
- разрешение сомнительных результатов на B12 — B12 = 150-250 пмоль/л.
Как основное тестирование — подозрение на дефицит кобаламина.

Что означают результаты?

Референсные значения: 25,1 — 165 пмоль/л.

Витамин В12, активный (ХолоТК) ефицит или недостаток кобаламина.

Витамин В12, активный (ХолоТК) > 35 пмоль/л — о тсутствие дефицита кобаламина; п ациенты с заболеваниями почек с такими концентрациями
ХолоТК должны быть далее обследованы на MMК (метилмалоновая кислота), высокие уровни MMК, несмотря на нормальные уровни ХолоТК, могут указывать на внутриклеточный дефицит кобаламина, который может быть подтверждён понижением уровней MMК при приёме препарата B12.

Измерение уровня витамина В12, активного (ХолоТК) даёт более точный индекс статуса B12, чем измерение уровня общего витамина B12.
Измерение уровня витамина В12, активного (ХолоТК) повышает чувствительность и специфичность раннего определения дефицита B12 у пациентов по сравнению с определением уровней общего В12 в сыворотке крови.

Кто назначает исследование?

Гематолог, терапевт, невролог, диетолог, гастроэнтеролог, онколог.

Литература

Nexo E, Hvas A-M, Bleie Ø, et al. Holotranscobalamin is an early marker of changes in cobalamin homeostasis. A randomized placebo-controlled study. Clin Chem 2002;48(10):1768-1771.
Valente E, Scott JM, Ueland P-M, et al. Diagnostic accuracy of holotranscobalamin, methylmalonic acid, serum cobalamin, and other indicators of tissue vitamin B 12 status in the elderly. Clin Chem 2011;57(6):856-863.
Nexo E, Christensen A-L, Hvas A-M, et al. Quantification of holotranscobalamin, a marker of vitamin B 12 deficiency. Clin Chem 2002;48(3):561-562.
Ulleland M, Eilertsen I, Quadros EV, et al. Direct assay for cobalamin bound to transcobalamin (holo-transcobalamin) in serum. Clin Chem 2002;48(3):526-532.

Источник

Витамин B12 (цианокобаламин)

Общая информация об исследовании

Определение концентрации витамина В₁₂ в сыворотке крови – стандартный метод диагностики его дефицита.

Витамин В₁₂ содержится исключительно в продуктах животного происхождения, таких как мясо (особенно печень и почки), рыба, яйца, молочные продукты. В последние годы важным источником витамина В₁₂, особенно для вегетарианцев, стали обогащенные им каши, хлеб, сухие завтраки и другие зерновые продукты.

В₁₂ важен для синтеза нуклеиновых кислот, образования эритроцитов, клеточного и тканевого обмена, к тому же он участвует в поддержании нормального функционирования нервной системы. Дефицит витамина В₁₂ может привести к развитию макроцитарной (мегалобластной) анемии. Основным ее проявлением является уменьшение количества эритроцитов в крови, но увеличение при этом их размера – образование макроцитов. Макроциты, как правило, имеют более короткую продолжительность жизни по сравнению с нормальными эритроцитами и больше склонны к гемолизу, что приводит к усталости, слабости и другим симптомам анемии. Недостаток витамина В₁₂ грозит поражением нервной системы (фуникулярным миелозом), которое проявляется в виде покалывания в ногах и руках пациента (дистальные парестезии), расстройстве чувствительности, повышении сухожильных рефлексов.

Основные причины дефицита витамина В₁₂ в организме

Недостаточное поступление. В₁₂ накапливается преимущественно в печени и селезенке. Так как запасы этого витамина в организме достаточно велики, а выведение происходит медленно, для создания значимого дефицита требуется около 5 лет недостаточного поступления его в организм. Соответственно, группами риска являются голодающие люди и вегетарианцы.

Нарушение всасывания. Дефицит В₁₂ иногда возникает при различных заболеваниях тонкой кишки, нарушающих всасывание этого витамина (целиакии, болезни Крона, снижении кислотности желудочного сока (ахлоргидрии), а также при уменьшении реабсорбирующей поверхности после резекции тощей кишки. Однако наиболее частая причина дефицита В₁₂ – пернициозная анемия. В основе этого заболевания лежит врождённая неспособность желудка секретировать вещество, необходимое для всасывания витамина В₁₂ в кишечнике.

Нарушение утилизации. Различные заболевания печени и почек, а также злоупотребление алкоголем приводит к снижению накопления и увеличению выделения витамина В₁₂.

Увеличение потребности организма в витамине. При различных заболеваниях, требующих большого количества витамина В₁₂, например гемолитической анемии, гипертиреозе и альфа-талассемии.

Для чего используется исследование?

В первую очередь, для выявления причин макроцитарной анемии.
Чтобы оценить состояние здоровья и сбалансированность питания пациентов с признаками недоедания и мальабсорбции, людей, страдающих алкоголизмом или различными формами нарушения всасывания (целиакией, болезнью Крона).
Пожилым людям тест на В₁₂ может помочь определить причину изменений в психике и поведении.
Пациентам, страдающим дефицитом витамина В₁₂, регулярное определение его концентрации позволяет контролировать процесс лечения. Особенно это актуально для людей с врождёнными дефектами всасывания витамина В₁₂, вынужденных принимать препараты всю жизнь.

Когда назначается исследование?

Если при общем анализе крови, проведенном рутинно или как часть диагностики симптомов анемии, обнаруживают эритроциты увеличенных размеров.
При выявлении причин изменений в поведении: появлении раздражительности, спутанности сознания, депрессии и/или паранойи (особенно у пожилых людей).
При неспецифических симптомах, указывающих на дефицит витамина В₁₂, таких как головокружение, слабость, усталость, изменения со стороны ЖКТ (глоссит, увеличение печени).
При необходимости проверки на дефицит B₁₂ пациентов с различными неврологическими нарушениями: парестезией и онемением рук и/или ног, нарушением чувствительности, периферической невропатией.
При исследовании здоровья пациентов с подозрением на недостаточное питание или на нарушение всасывания витамина В₁₂, при различных заболеваниях кишечника.
Когда дефицит В₁₂ обнаружен у ребенка, находящегося на грудном вскармливании, необходимо обследовать его мать на нехватку этого витамина.
Периодический контроль уровня В₁₂ позволяет оценить эффективность лечения авитаминоза.

Источник