Стадии производства витамина в12

Стадии производства витамина в12

Строение и свойства кобаламинов >[126, 138, 139]

Витамин В₁₂ представляет собой группу соединений (кобаламинов), предотвращающих развитие злокачественной анемии и дегенеративные изменения нервной ткани. Механизм действия таких соединений (витамеров) связан с участием их коферментных форм (кобамидных коферментов) в ферментативных реакциях.

Основные представители витамина В₁₂ приведены на рис. 15.7.18.

Рис. 15.7.18. Строение кобаламинов: 18 — цианокобаламин; 19— аквакобаламин; 20 — гидроксокобаламин; 21 — метилкобаламин; 22 — коэнзим В₁₂; 23—– 5,6-диметилбензимидазол

Кобаламины разлагаются на свету, разрушаются под действием окислителей и восстановителей; при рН = 4,0÷7,0 в водных растворах они достаточно устойчивы. Некоторые свойства кобаламинов приведены в табл. 15.7.102.

Таблица 15.7.102

Свойства основных кобаламинов [139]

Цианокобаламин (18) является лекарственной формой витамина В₁₂, не встречающегося в природе. Группа CN легко и обратимо замещается другими лигандами, например, OH, NO₂, SO₃, CH₃.

Гидроксокобаламин (20) является одной из основных форм витамина В₁₂, в виде которой он транспортируется белками крови и депонируется в организме.

Витамеры В₁₂ синтезируются почти исключительно микроорганизмами, особенно актиномицетами и синезелеными водорослями [140].

Витамин В₁₂ — один из наиболее эффективных противоанемических препаратов, его используют для лечения злокачественного малокровия, постгеморрагических и железодефицитных анемий, анемий алиментарного характера и других видов анемий. Назначают витамин также для лечения костных тканей после перелома [70], при лучевой болезни, дистрофии у недоношенных и новорожденных детей после перенесенных инфекций, при заболеваниях печени, полиневритах, радикулите, кожных заболеваниях, травматических поражениях периферических нервов и других болезнях.

Широкое применение витамин В₁₂ нашел в сельском хозяйстве; добавка витамина увеличивает прирост животных на 10–15 % [70].

Промышленное производство витамина В₁₂ [138, 139]

Наиболее активными продуцентами витамина являются пропионовокислые бактерии (Propionibacterium), некоторые представители рода Pseudomonas и метаногенные бактерии. В промышленности производятся препараты витамина двух видов: витамины для медицинских целей и кормовые препараты.

Из примерно 10 т ежегодно выпускаемого в мире витамина В₁₂ 3,5 т приходится на цианокобаламин, 2 т на оксикобаламин, 1 т на коэнзим В₁₂ и небольшое количество на метилкобаламин; эти формы используются в медицине [108]. Остальное количество витамина применяется в животноводстве. По другим данным производство витамина В₁₂ составляет около 20 тыс. т [140].

Получение медицинских препаратов. Пропионовокислые бактерии занимают одно из центральных мест среди продуцентов витамина. Природные штаммы синтезируют 1,0–8,5 мг/л корриноидов, промышленный мутант P. shermanii M-82, используемый в качестве продуцента, образует до 58 мг/л витамина.

Использование пропионовокислых бактерий [138]. В России медицинские препараты витамина получают с использованием мутантных штаммов Propionibacterium shermanii и Propionibacterium freudenreicheii, которые способны синтезировать более 10 мг/л целевого продукта. Культивирование пропионовокислых бактерий осуществляется периодическим способом на средах сложного состава, содержащих кукурузный экстракт, глюкозу, соли кобальта, сульфат аммония. Обязательным условием высокого выхода витамина является наличие в среде предшественника витамина — 5,6-диметилбензимидазола (23, 5,6-ДМБ). Выделение целевого продукта осуществляется экстракцией растворителем, сорбцией на ионитах, осаждением или сочетанием этих способов.

Исходную культуру поддерживают на твердой питательной среде следующего состава, г: глюкоза — 20, кукурузный экстракт — 20, аммоний сернокислый — 2, кальций углекислый — 20, вода — 1,0 л, рН среды после стерилизации — 6,8–7,0.

Далее готовят посевной материал путем последовательного размножения бактерий сначала в пробирках по 30 мл, затем в колбах по 500 мл и последовательно в аппаратах емкостью 100 и 1000 л. Приготовление посевного материала проводят в анаэробных условиях в течение 2–4 сут при 30 °С на среде аналогичного состава с добавлением 0,005 г хлористого кобальта. Предварительное выращивание культуры для производства витамина В₁₂ занимает обычно до 18 сут.

Многоступенчатость этого процесса связана с большим расходом посевной культуры на засев (10–20 об. % от объема среды). В противном случае рост бактерий замедляется, что может привести к низкому уровню накопления витамина и заражению КЖ посторонней микрофлорой.

Заключительную ферментацию проводят также в анаэробных условиях.

Ферментация проходит в две фазы. Первая длится 67 ч (с момента засева среды культурой бактерий до внесения 5,6-ДМБ) и протекает в строго стерильных условиях при 28–30 °С. При этом происходит размножение бактерий с интенсивным нарастанием биомассы (50–55 ч ферментации), сопровождаемое образованием пропионовой и уксусной кислот, которые нейтрализуются добавлением 40% раствора едкого натра или аммиачной воды, поддерживанием рН на уровне 6,5–7,0. В первой фазе Р. Shermanii накапливает в основном (80 % и более) не содержащий нуклеотидного основания предшественник витамина В₁₂ (фактор В), а также некоторое количество полных корриноидов, в том числе кобаламин (8–10 %), псевдовитамин В₁₂ и фактор А.

Трансформация этих продуктов в активную для человека и животных форму витамина В₁₂ (кобаламин) происходит во второй фазе ферментации в результате внесения в среду 5,6-ДМБ (10–20 мг/л) в условиях аэрации (2 м 3 /ч). За это время фактор В и часть других аналогов витамина В₁₂ переводятся в кобаламин, содержащий в нуклеотидной части молекулы добавленное азотистое основание. КЖ содержит к концу процесса до 30 мг/л витамина В₁₂, накопленного в клетках бактерий.

Для экстрагирования витамина клетки нагревают при 80–120 °С в течение 30 мин при рН = 6,1÷ 8,5.

Превращения в кобаламин достигают, обрабатывая горячий раствор или клеточную суспензию цианидом или тиоцианатом, часто в присутствии NaNO₂ или хлорамина В₁₂.

Корриноиды сорбируют на различных носителях: амберлите IRC-50, Al₂O₃, активном угле и элюируют водными спиртами или водно-фенольными смесями.

Из водных растворов корриноиды экстрагируют фенолом или крезолом, либо смесью этих фенолов с бензином, бутанолом, тетрахлоридом углерода или хлороформом.

Чистота кристаллического цианокобаламина — не менее 96 %. Выход продукта обычно составляет 50–60 % от его содержания в исходной культуральной жидкости.

Аэробная ферментация с применением Pseudomonas denitrificans [138]. Фирма «Мерк» использует один из высокоактивных продуцентов рода Pseudomonas для промышленного получения витамина с помощью мутантного штамма Ps. denitrificants МВ 2436. Процесс состоит из трех стадий.

I. Посев лиофилизированной культуры в пробирку с агаризованной средой (рН = 7,4) состава:

Культивирование ведут 4 дня при 28 °С.

II. Приготовление посевного материала, для чего культуру смывают с пробирки в 150 мл жидкой среды того же состава, но без агара. Культивируют в конических колбах объемом 1,0 л в течение 3 сут. при 28 °С на роторной качалке.

III. На стадии основной ферментации посевной материал (150 мл) вносят в ферментер объемом 5 л, содержащий 3,3 л производственной среды с рН = 7,4, в состав которой входят:

Ферментацию проводят в течение 90 ч при 28 °С, при непрерывном перемешивании (420 мин –1 ) и аэрации (0,2 м 3 /ч); накопление витамина достигает 59 мг/л.

Выделение и очистка продукта включают прогревание КЖ при 120 °С в течение 30 мин, перевод экстрагированного витамина в цианоформу (добавление цианистого калия), фильтрацию, двукратную экстракцию корриноидов органическими растворителями (смесь крезол : четыреххлористый углерод 1 : 2), хроматографию на оксиде алюминия.

Выход кристаллического цианокобаламина 98% чистоты составляет 75 % от его содержания в культуральной жидкости.

Получение кормовых препаратов [138] Высокой кобаламиносинтезирующей активностью обладают метаногенные бактерии рода Methanosarcina; особого внимания заслуживает галофильный штамм вида Methanococcus halophilus, который синтезирует более 16 мг корриноидов/1 г биомассы. Разработаны методы получения кормовых препаратов витамина В₁₂. Широкое применение нашли два способа получения витаминных препаратов путем метанового брожения сложных питательных сред.

Мезофильный процесс основан на мезофильном метановом брожении экспериментально подобранной питательной среды следующего состава, кг/м 3 :

Пивные дрожжи служат источником витаминов (разд. 15.7.4). Перед внесением в среду их смешивают с водой и кипятят 10 мин. Печень вводят в качестве источника ферментов, катализирующих образование из глицина и янтарной кислоты предшественника витамина В₁₂ d -аминолевулиновой кислоты. Печень измельчают и настаивают в течение 24 ч с водой при температуре +5 °С, затем добавляют глицин и янтарную кислоту, выдерживают смесь 2 ч при 35 °С и вводят в среду.

Ферментацию проводят в заполненных на 90 % емкостях объемом 500–1000 м 3 при 35 °С, ежесуточно заменяя 10 % сброженной КЖ свежим субстратом. Выход корриноидов составляет 16–18 мг/л, из них 50–60 % приходится на долю истинного витамина В₁₂ (кобаламина), 20–30 % — фактора Ш (5-оксибензилиндазол), а остальное количество кобаминов представлено фактором В и другими аналогами. Путем увеличения концентрации некоторых питательных компонентов среды и совершенствования режимов ферментации можно повысить накопление корриноидов до 40 мг/л. Сброженную культуральную жидкость используют для получения медицинских и кормовых препаратов витамина В₁₂, состав которых зависит от назначения и условий применения.

В термофильном процессе, промышленно освоенном в нашей стране, в качестве сырья используют отходы (барду) ацетонобутиловых и спиртовых заводов, перерабатывающих зерно и мелассу. В этих отходах остаются достаточные количества углеводов, азотсодержащих органических соединений и минеральных компонентов (табл. 15.7.103).

В качестве продуцента используется смешанная культура метанообразующих бактерий. Брожение проводят нeпpерывным способом в метантенках объемом 4–5 тыс. м 3 в термофильных условиях (56 °С) с ежесуточной заменой 20–25 % бродящего субстрата свежей бардой. К барде добавляют 0,5–1,0 об. % метанола и 4–10 г/м 3 хлористого кобальта; в качестве биостимуляторов вносят карбамид и диаммонийфосфат.

Технологическая схема производства включает в себя следующие стадии: сбраживание мелассной барды; подкисление метановой бражки до рН = 5,5÷6,5, упаривание метановой бражки, высушивание, фасование кормового концентрата витамина В₁₂.

Культуру метанообразующих бактерий размножают, применяя в качестве посевного материала метановую бражку.

Таблица 15.7.103

Состав ацетонобутиловой и спиртовой барды [138]

Исходная барда практически стерильна. Перед подачей в ферментеры ее охлаждают до 55–57 °С, устанавливают рН (7,5–8,0) и задают культуру метанообразующих бактерий. Метановое брожение протекает в две стадии: на первой (кислотном брожении) углеводы, белки и жиры превращаются в органические кислоты; на второй происходит повышение рН, т. к. азотистые вещества и кислоты разлагаются с образованием аммонийных соединений. При метановом брожении выделяются газы, содержащие 60–70 % метана. Для активирования жизнедеятельности бактерий в метантенки добавляют суспензию кормовых дрожжей.

Процесс метанового брожения контролируют по значению рН, содержанию летучих кислот и витамина В₁₂. Культура должна иметь рН = 7,5÷8,5; если он ниже 7,5, а содержание летучих кислот выше 4,5 г/л, уменьшают приток барды. В 1 м 3 метановой бражки накапливается 1,2–2,0 г витамина В₁₂.

Интенсивность метанового брожения вторичной барды ниже, чем первичной. Добавление во вторичную барду источника азота в виде мелассы, дрожжевого автолизата, сульфата аммония или кукурузного экстракта способствует большему накоплению витамина. Газы, образующиеся при метановом брожении, направляют в газгольдер, а затем сжигают в топках паровых котлов.

Метановую бражку перед упариванием нейтрализуют HCl до рН = 5,5÷6,5 с целью предотвращения термического разложения витамина. Затем ее нагревают до 90 °С и направляют в дегазатор.

Упаривание метановой бражки (3,5–4,0 % СВ) осуществляют в четырехкорпусной установке (температура кипения 125–128, 115, 100 и 75–78 °С соответственно) до концентрации СВ 35–40 %. Упаренную бражку высушивают в распылительной сушилке до влажности 3,7–10 % и получают сухой кормовой концентрат витамина В₁₂ (КМБ-12), который должен удовлетворять требованиям ГОСТ 18663–78 (табл. 15.7.104).

Таблица 15.7.104

Характеристика препарата КМБ-12 [70]

Готовый продукт содержит также в 1 кг концентрата, мг: тиамина — 1,5–1,6, рибофлавина — 50–60, никотиновой кислоты — 80–90, пиридоксина — 40–50 и биотина — 0,35–0,40. Расход концентрата составляет 4–4,5 кг/1 т кормов.

Источник