Propionibacterium (пропионовокислые бактерии или пропионибактерии)
Пропионовокислые бактерии или пропионибактерии (лат. Propionibacterium) — род грамположительных факультативных анаэробных неподвижных бактерий, синтезирующих в процессе метаболизма пропионовую кислоту. Propionibacterium обычно имеют вид острых палочек размером 0,5-0,8 на 1,0-1,5 мкм. Реже, в зависимости от условий и цикла развития — кокковидной, изогнутой или булавовидной. Propionibacterium размножаются делением на две клетки и не образуют спор.
Пропионовокислые бактерии являются возбудителями пропионовокислого брожения, при котором углеводы ферментируются с образованием главных продуктов брожения — пропионовой кислоты и её солей — пропионатов. Пропионовокислое брожение аналогично молочнокислому брожению, когда молочнокислые бактерии (лактобактерии, стрептококки и другие представители порядка Lactobacillales) превращают (сбраживают) лактозу, глюкозу и другие углеводы в молочную кислоту. Кроме пропионовой кислоты, пропионовокислые бактерии продуцируют уксусную кислоту, углекислый газ и др.
Propionibacterium не обитают в почве и водоёмах, они встречаются в желудочно-кишечном тракте жвачных животных, часто обнаруживаются в молочных продуктах. Процесс сбраживания молока пропионибактериями довольно медленный — 5–7 дней.
Большинство пропионибактерий не может развиваются при значениях кислотности среды менее 5,0–4,5 рН. Propionibacterium переносят лишь низкое парциональное давление кислорода. Оптимальная температура их развития 30–35°С, при температуре 60–70°С они погибают. Propionibacterium кроме сахаров и молочной кислоты, способны сбраживать пировиноградную кислоту, глицерин и другие вещества. Они разлагают аминокислоты, при этом выделяются жирные кислоты.
Ряд видов Propionibacterium способны продуцировать витамин B12. Это качество пропионибактерий используются при производстве витаминов.
Пропионовокислые бактерии в пробиотиках и пищевой промышленности
Всемирная гастроэнтерологическая организация отмечает, что имеются доказательства, что пробиотик на основе четырёх штаммов: Propionibacterium freudenreichii ssp. shermanii, Lactobacillus rhamnosus GG, Lactobacillus rhamnosus LC705 и Bifidobacterium breve Bb99 уменьшает некоторые симптомы при синдроме раздраженного кишечника (WGO. Пробиотики и пребиотики).
Штамм КМ-186 Propionibacterium freudenreichii ssp. shermanii входят в состав отечественных БАДов «Йодпропионикс» и «Селенпропионикс».
Штаммы пропионовокислых бактерий вида Propionibacterium freudenreichii широко применяют в пищевой промышленности для ферментации молочных продуктов. Сыр Эмменталь и другие сорта швейцарских сыров ферментируются из молока в две стадии: на первой — лактоза и другие углеводы молока сбраживаются с помощью молочнокислых бактерий в молочную кислоту, на второй — молочнокислая кислота с помощью пропионовокислых бактерий превращаются в пропионовую кислоту и углекислый газ (формирующий «дырки» в швейцарском сыре).
Кроме того, в производстве сыров используют виды Propionibacterium acidipropionici*, Propionibacterium jensenii*, Propionibacterium thoenii*.
Пропионовокислые бактерии в организме человека
Некоторые виды Propionibacterium обитают на коже человека и других животных, в основном в и вокруг потовых желез, сальных желез и на других участках кожи, являясь одними из наиболее часто встречающихся микроорганизмов на коже человека. Пропионибактерии являются преобладающим родом бактерий на так называемых «масляных» участках кожи (в отличие от «сухих» и «влажных»): складках у крыла носа, внешнем слуховом канале, рукоятке грудины, позади ушной складке, а также на спине.
Могут ли пропионовокислые бактерии вызывать болезни человека?
У большинства людей пропионовокислые бактерии обычно не вызывают никаких проблем со здоровьем. Заболевания человека вызывают лишь некоторые из видов пропионовокислых бактерий, живущих на коже человека.
Вид Propionibacterium acnes* является одним наиболее часто встречающимся возбудителем инфекционной формы акне (в быту называемой угри) — заболевания сальных желёз. Кроме того, Propionibacterium acnes может вызывать блефарит (воспаления век), эндофтальмит (гнойное воспаление внутренних оболочек глазного яблока), и другие заболевания глаза, в частности, являющиеся осложнениями после офтальмологических операций.
Propionibacterium propionicum* может вызывать актиномикоз (редко).
Пропионибактерии, применяемые в пищевой промышленности и пробиотиках и обитающие в кишечнике человека, в отличие от некоторых из живущих на коже видов, не вызывают заболеваний.
Антибиотики, активные в отношении пропионовокислых бактерий
Пропионовокислые бактерии в систематике видов
По современной классификации род Propionibacterium входит в семейство Propionibacteriaceae, порядок Propionibacteriales, класс Actinobacteria, тип Actinobacteria, Terrabacteria group, царство Бактерии.
В род пропионовокислых бактерий входят виды: Propionibacterium acidifaciens, Propionibacterium australiense, Propionibacterium cyclohexanicum, Propionibacterium freudenreichii.
В составе вида Propionibacterium freudenreichii выделяют два подвида:
- Propionibacterium freudenreichii ssp. freudenreichii
- Propionibacterium freudenreichii ssp. shermanii
*Недавно род Propionibacterium был разделён на 4 рода: Propionibacterium, Acidipropionibacterium, Cutibacterium, Pseudopropionibacterium. Все они остались в составе семейства Propionibacteriaceae и, как продуценты пропионовой кислоты, также могут называться пропионовокислыми бактериями. Исключённые из рода Propionibacterium виды были реклассифицированы следующим образом:
- Propionibacterium acidipropionici —> Acidipropionibacterium acidipropionici
- Propionibacterium acnes —> Cutibacterium acnes
- Propionibacterium avidum —> Cutibacterium avidum
- Propionibacterium granulosum —> Cutibacterium granulosum
- Propionibacterium jensenii —> Acidipropionibacterium jensenii
- Propionibacterium microaerophilum —> Acidipropionibacterium microaerophilum
- Propionibacterium thoenii —> Acidipropionibacterium thoenii
- Propionibacterium propionicum —> Pseudopropionibacterium propionicum
Последний вид Propionibacterium propionicum ранее назывался Arachnia propionica и входил в род Arachnia, который ещё до вышеупомянутого разделения рода Propionibacterium на четыре был включён в него в полном составе.
Бактерии из рода Arachnia также относились к анаэробным микроорганизмам, они продуцировали в качестве основной пропионовую кислоту, а дополнительной — уксусную (Ардатская М. Д., Минушкин О. Н.).
Источник
Пропионовокислые бактерии являются продуцентами витамина
ВСЕСОЮЗНЫЙ НЯУЧНО-ИССЛЕДОВЛТЕЛЬСКИЙ ПРОЕКТНО-КОНСТРУКТОРСКИЙ ИНСТИТУТ ПРИКЛАДНОЙ БИОХИМИИ
На правах рукописи
ГАНИЧЕВА Тамара Викторовна
МУТАГЕНЕЗ ПРОПИОНОВОКИСЛЫХ БАКТЕРИЙ -ПРОДУЦЕНТОВ ВИТАМИНА В-12
Специальность 03. 00. 23 — Биотехнология
АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Работа выполнена на Курганском комбинате медицинских препаратов и изделий «Синтез».
Научный руководитель — доктор биологических наук,
профессор Воробьева Л. И.
Официальные оппоненты — доктор биологических наук
Ведущее предприятие — Институт биохимии им. А. А. Баха РАН, г. Москва.
на заседании специализированного совета 0. 98. 07. 01 Всесоюзного научно-исследовательского проектно-конструкторского института прикладной биохимии.
Отзывы на автореферат, заверенные печатью, просим направлять по адресу: 125299, Москва, ул. К- Цеткин, д. 4/6, ВНИИбиохиммашпроект, ученому секретарю.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВНИИбиохиммашпроекта.
Автореферат разослан « . »1992 г
кандидат биологических наук Захарова Г. М.
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. Витамин В-12 нашел большое применение в медицинской практике и животноводстве для лечения различных заболеваний. Это единственный из витаминов, который синтезируется только бактериями. Промышленное производство в нашей стране основано на культивировании пропионовокислых бактерий. Необходимым условием современной микробиологической промышленности является использование высокопродуктивных штаммов. Получение штаммов возможно двумя способами: с помощью методов генной и клеточной инженерии; путем мутагенеза и последующего отбора.
Методы генной и клеточной инженерии значительно расширяют возможности селекции микроорганизмов, но не исключают уже существующие методы традиционной селекции.
Биосинтез витамина В-12 связан с работой большого числа генов, многие из которых в последние годы удалось трансформировать. Однако клонирование генов пока не осуществлено, поэтому главным способом повышения содержания корриноидов в клетках пропионовых бактерий является индуцированный мутагенез.
Цель диссертационной работы: интенсификация промышленного получения витамина В-12 путем селекционирования высокопродуктивного штамма — продуцента витамина В-12; оптимизация условий его культивирования и внедрение этого штамма в производство. Для этого предстояло решить следующие задачи:
— изучить спонтанную изменчивость штамма М-82 Р. БиегтапЦ используемого в производстве;
— изучить индуцированную изменчивость этой культуры под действием различных мутагенов;
— получить высокопродуктивный штамм пропионовокислых бактерий с помощью мутагенеза;
— изучить физиолого-биохимические особенности высокопродуктивного штамма;
— осуществить поиск путей интенсификации процесса ферментации при промышленном получении витамина В-12.
Научная новизна работы заключается в следующем:
I. Впервые в качестве мутагенных факторов в селекции пропионовых бактерий использованы производные дигидроимидазотиазолов, изучены особенности их мутагенного действия.
2. Путем сравнительного анализа различных физиологических свойств мутантного штамма 1-63 выявлен комплекс отличительных признаков в сравнении с исходным штаммом, что позволило отработать оптимальные параметры культивирования нового штамма.
3. Выявлено стабилизирующее действие клеточного экстракта пропионовых бактерий на индуцированную изменчивость культур р _ Eher manii, Pen.chrysogenum, Act.kanamyceticus.
Практическая значимость работы. Получен оригинальный штамм 1-63, превышающий исходный штамм М-82 по влтаминообразованию в лабораторных условиях на 36$, в производственных — на 20$.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 3 работы в периодических журналах и сборниках. Подана заявка на изобретение. Получено положительное решение от 25 декабря 1990 г.
Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, трех глав с изложением полученных экспериментальных данных и их обсуждения, выводов и списка литературы. Диссертация изложена на 125 страницах машинописного текста, включает 32 таблицы и 22 рисунка. В список литературы входит 72 работы отечественных авторов и 63 — зарубежных.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ
Объектом исследования служил штамм М-82 — Propionibacterium shermanii продуцент витамина B-I2, на основе которого осуществлялось производство этого витамина на Курганском комбинате «Синтез» и штамм 1-63, полученный в процессе работы.
Для поддержания культуры, получения и отбора мутантов использовали агаризованную среду следующего состава (%): глюкоза — 2,0, кукурузный экстракт — 2,0, сернокислый аммоний — 0,2, мел — 2,0, хлористый кобальт -0.Q005, агар-агар — 2,0. Колонии выращивали в анаэростате в течение 10 суток. Определение продуктивности по признаку витаминообразования проводили на среде следующего состава(%) глюкоза — 3,0, лактоза — 1,0, кукурузный экстракт — 7,0, сернокислый аммоний — 0,2, хлористый кобальт — 0,001.Ферментацию проводили в стационарных условиях в колбах Эрленмейера емкостью 250 мл, содержащих 200 мл среды. Кислоты, выделяющиеся в процессе ферментации, нейтрализовали 40%-ным. раствором иаон • ^ культуральную жидкость после 72 часов роста вносили предшественник витамина B-I2 5,6-диметилбензимидазол и выдерживали с ним культуральную жидкость в течение 48 часов. Содержание витамина B-I2 определяли физико-
химическим методом Шешикова и др., 1979). Идентификацию кофер-ментной формы витамина B-I2 проводили методом хроматографии на бумаге ( Holdswor-fch , 1953,’ Paweiltiewiez, Walerych , 1959). Отбор вариантов, чувствительных к различным мутагенным факторам, проводили по следующей методике. Односуточную культуру бактерий плотностью Ю9 клеток/мл выращивали на среде следующего состава (%) : кукурузный экстракт — 2,0, глюкоза — 2,0, мел — 2,0, сернокислый аммоний — 0,2. Рассев клеток пропионовокислых бактерий, подвергнутых воздействию какого-либо мутагена, производили на агаризован-ную среду и выращивали в течение 10 суток. Выживаемость определяли путем сравнения количества колоний, подвергнутых воздействию мутагена и колоний контроля. Каждую колонию проверяли на содержание витамина 3-12 описанным выше способом.
В качестве мутагенных факторов использовали ультрафиолетовые лучи в комбинации с N — нитрозо — N — метилбиуретом (НМБ),НМБ, пары диэтилсульфата (ДЭС), акридин — иприт, гидрохлорид -б»- (2-буток-си-5-ацетилбензил) изотиомочевину, гидрохлорид-3-(3-хлор-4-пропок-сифенил) 5,6- дигидроимидазо — (2,1 — ^ ) тиазол.
Источником ультрафиолетовых лучей служила лампа БУВ-15. Пары ДЭС действовали на культуру прзпионовых бактерий, выращенных на скошенном агаре в пробирке. Нитрозоалкильные соединения, акридин-иприт и производные дигидроимидазотиазолов использовали в виде 0,2% и 0,6% растворов, исходная концентрация которых вдвое превышала необходимую. Для обработки сливали равные объемы растворов мутагена и суспензии клеток. Обработку проводили при 29° С на качалке в течение 30 и более минут. Действие мутагена снимали быстрым разведением суспензии в дистиллированной роде или соответствующем буфере.
ИЗМЕНЧИВОСТЬ ПРОПИОНОВОКИСЛЫХ БАКТЕРИЙ ПОД ДЕЙСТВИЕМ РАЗЛИЧНЫХ МУТАГЕНОВ
В работе использовали ряд традиционных мутагенов, широко применяемых в селекции промысленных микроорганизмов, таких как N -ни-трозо-N -метилбиурет (НМБ), Н.ЧБ + УФ-лучи, пары ДЭС, акридин-иприт, а такке производные дигидроимидазотиазолов, относящиеся к лекарственным формам. За исключением ДЭС, все зьие перечисленные мутагены ранее не использовались в селекции пропионовых бактерий.
На первых этапах изучали мутагенную и летальную активность 1К/1Б как одного, так и в сочетании с УФ-лучами. НМБ относится к классу нитрозоалкиламидов и обладает по отношению к различным продуцента. высокой инд,уцирук1;;;е:»: способностью образовывать стабильные
по признаку антибиотикообразования мутанты (Домрачева и др., 19′ Летягин и др., 1975; Шувалова и др., 1976; Жукова и др., 1979; Романова и др., 1982; Русинов и др., 1983). Для НМБ характерно одновременно с высокой мутагенной активностью, наличие слабой i тальности.
Мутагенная активность НМБ определяется продуктами его расг да в зависимости от рН обработки. При кислом рН НМБ образует к бомоизоцианат и в этом случае продукты распада взаимодействуют нуклеиновыми кислотами в качестве карбомоилирующего агента (Сер бряный и др., 1973). В щелочной среде НМБ распадается на диазоа каны, время существования которых невелико, обладающие более си ным мутагенным и летальным действием, чем карбомоизоцианат ( lii élis et al. , > 1965).
Наши исследования были направлены на изучение зависимости мутагенного эффекта НМБ от условий обработки. Обнаружено, что в слабокислой среде при рН 6,0 (табл. I) мутагенный эффект НМБ во растает, но при этом наблюдается рост низкоактивных вариантов, щелочной среде при значении рН 9,0 также индуцируются низкоакти ные по содержанию витамина B-I2- мутанты (табл. I).
Под действием НМБ на пропионовые бактерии возникает большо число морфологических мутантов, которые можно разделить на две группы. Первую группу составляют мутанты бордового, красного, к ричневого, белого цветов, по размеру не отличающиеся от контрол вторую — карликовые колонии, имеющие диаметр менее I мм и окраш ные в кремовый цвет. Показано, что морфологические мутанты соде жат незначительное количество корриноидов, поэтому в дальнейшем анализировали на продуктивность только типичные по размеру и цв ту колонии (розовые с диаметром 3-4 мм). Полученные данные подтвердили результаты исследователей (Воробьева и др., 1973; Груз на и-др., 1973, 1974; Купенов, 1973; Рослякова, 1974), что под действием нитрозоалкильных соединений НЭМ, НИМ и НГ, возникает большое количество морфологических мутантов, отличающихся как ц1 том, так и размером и характеризующихся низкой витаминообразухиф способностью.
Использование НМБ в комплексе с УФ-лучами в качестве мутап ного фактора привело к возрастанию летального эффекта в три раз: по сравнению с действием^только одного НМБ (табл. I). Мутагсниьн эффект выразился» в возрастании числа высокопродуктивных вариант! Однако мутанты, обладающие высокой кобамидной активностью, и по;
Индуцированная изменчивость культуры ¿Ьсг/пол/’/ под действием различных мутагенов
Распределение по классам, продуктивности » по отношению к контролю, %
Источник