Полиморфизм генов рецепторов витамина
На протяжении последних лет сохраняется устойчивая тенденция к росту патологии костно-мышечной системы среди подростков. Резко вырос уровень заболеваемости дистрофической патологией заболеваний опорно-двигательного аппарата, ранним остеохондрозом, увеличилась частота переломов костей, вызванных неадекватно малой травмой. У 70% подростков наблюдаются замедление темпов созревания скелета и недостаточная минерализация костной ткани, согласно эпидемиологическим данным у 10–30% обследованных 1-й и 2-й групп здоровья отмечено снижение минеральной плотности костной ткани [1].
Генетически детерминированная костная масса при развитии скелета до 80% накапливается в детском и пубертатном возрасте, уровень потери плотности ткани у лиц старших возрастных групп зависит от ее пиковой массы, сформированной в молодом возрасте [2, 3]. Эти данные обусловливают повышенный интерес к проблеме развития патологии костной системы у подростков, которая является актуальной для современной педиатрии. Помимо наследственных факторов на формирование минеральной плотности костей оказывают влияние факторы внешней и внутренней среды [4]. С указанной позиции для своевременной диагностики ранних стадий заболеваний необходимы совершенствование биохимических методов оценки минеральной плотности костной массы у детей, отражающих процессы остеосинтеза и костной резорбции, а также исследование молекулярно-генетических маркеров. Это дает основание для поиска и идентификации генов – кандидатов предрасположенности к патологии костно-мышечной системы с помощью методов, которыми располагает молекулярная генетика на сегодняшний день. Также изучение взаимосвязей между биохимическими маркерами состояния костной системы и генами-кандидатами, участвующими в регуляции костного метаболизма и детерминирующими минеральную плотность костной ткани, вызывает обоснованный научный интерес. Подобные данные позволят более углубленно изучить патогенез нарушений костного метаболизма у подростков и тем самым назначить адекватную терапию, а значит, предупредить развитие патологии у лиц старших возрастных групп.
Обмен кальция и фосфатов костной ткани регулируется при участии витамина D путем взаимодействия его гормонально-активной формы кальцитриола 1,25(OH)2 D3 с рецепторами клеток. Рецептор к кальцийтриолу (витамину D, VDR) (или NR1I1) относится к семейству ядерных транскрипционных белков и принимает участие не только в процессе транскрипции, но и в механизме посттранскрипции, контролируемом микроРНК. В организме человека рецептор витамина D кодируется геном, локализованным в 12-й хромосоме (регион 12q13), который оказывает влияние на минеральную плотность костной ткани в организме и обусловленную развитием скелета длину тела [5–7]. Однако известно, что дефицит продукции гормонов щитовидной железы у детей приводит к прекращению роста и созреванию костей, тогда как тиреотоксикоз ускоряет эти процессы. А у взрослых тиреотоксикоз является важной и общепризнанной причиной вторичного остеопороза [8, 9].
Цель работы: изучить диагностическую значимость генетических (ген рецептора витамина D ) и биохимических маркеров (гормоны щитовидной железы) минерального метаболизма и в оценке состояния костной системы у подростков.
Материал и методы исследования. Изучено состояние здоровья 78 подростков (36 мальчиков и 42 девочек) в возрасте от 15 до 17 лет, учащихся общеобразовательных учреждений г. Владивостока. Распределение по группам здоровья проводили в соответствии с общепринятыми рекомендациями Института гигиены детей и подростков. Для оценки физиологических параметров состояния костно-мышечной системы использован метод активного интервью согласно разработанной индивидуальной карте. Для молекулярно-генетического анализа использованы образцы ДНК, извлеченные из лейкоцитов крови с помощью наборов для выделения «Экстра ДНК Био» («Алкор Био», Россия). Для определения полиморфных вариантов rs731236 c.1056 T/C гена внутриклеточного рецептора витамина D VDR методом ПЦР в реальном времени на амплификаторе модели PicoReal (США) использовали набор реагентов производства компании ООО «Генотехнология» (Россия).
Количественное выявление свободного тироксина в сыворотке крови проводили с помощью метода твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА, набор реагентов «ТироидИФА-свободный Т4», Россия). Регистрация оптической плотности исследованных образцов проводилась на приборе Multiskan FC версия ESW 1.00.96 (Thermo Scientific, США) с помощью программы «BiometraBDA/BioDocAnalyze» (Biometra, США). В методе использован вариант конкурентного твердофазного иммуноферментного анализа, при котором устанавливается равновесие между конъюгатом и свободным тироксином образца в процессе связывания с антителами, иммобилизированными на внутренней поверхности лунок планшета. Количество связанного антителами конъюгата обратно пропорционально количеству свободного тироксина в исследуемом образце, количество которого определяли на основании калибровочного графика. Аналогично было изучено содержание трийодтиронина («ТироидИФА-трийодтиронин», Россия) и тироксина в сыворотке крови (ТироидИФА-тироксин, Россия).
Методы статистической обработки, применяемые в работе для оценки достоверности результатов, проводились в Microsoft Excel с помощью сводных таблиц и описательных статистик из подключаемого пакета анализа Statistika 10.0 для персонального компьютера. Описательный анализ включал определение среднего арифметического значения, стандартного отклонения, ошибки среднего значения ( m ) при вычислении критерия [C1] Стьюдента. Для изучения влияния фактора на риск развития патологии костно-мышечной системы у подростков рассчитывали критерий Фишера ( F ) на основе четырехпольной таблицы сопряженности исходя из количества исследуемых. Использовали известные графические приемы для выражения статистических данных. Критический уровень значимости (р) при проверке статистических гипотез в исследовании принимался равным 0,05.
Результаты исследования и обсуждение. Согласно нашим данным из 78 человек в первую группу здоровья вошли всего два человека, остальные были отнесены ко второй (2,3% и 97,7% соответственно). Правильная осанка была выявлена у 63% детей, причем у мальчиков этот показатель преобладал и составлял 73% против 54% у девочек. Гиперкифоз наблюдался у девочек чаще, чем у мальчиков: 15% против 9%, так же как и выпрямленная осанка – 22% против 14%. Х-образная форма ног преобладала у девочек и встречалась в 25% случаев, а у мальчиков – в 19%.
Согласно генетическому тестированию обследуемые были распределены на группы соответственно распределению аллелей полиморфного маркера rs 731236 T/C гена внутриклеточного рецептора витамина D VDR на следующие генотипы: Т/С, С/C, T/T (табл. 1). Первую группу составили 52 человека (66,7%), вторую – 10 человек (12,8%), третью – 16 человек (20,5%).
Распределение полиморфизма гена рецептора витамина D ( VDR )
согласно возрасту и полу обследуемых
Распределение аллелей гена рецептора к витамину D
Источник
Полиморфизм генов рецепторов витамина
На протяжении последних лет сохраняется устойчивая тенденция к росту патологии костно-мышечной системы среди подростков. Резко вырос уровень заболеваемости дистрофической патологией заболеваний опорно-двигательного аппарата, ранним остеохондрозом, увеличилась частота переломов костей, вызванных неадекватно малой травмой. У 70% подростков наблюдаются замедление темпов созревания скелета и недостаточная минерализация костной ткани, согласно эпидемиологическим данным у 10–30% обследованных 1-й и 2-й групп здоровья отмечено снижение минеральной плотности костной ткани [1].
Генетически детерминированная костная масса при развитии скелета до 80% накапливается в детском и пубертатном возрасте, уровень потери плотности ткани у лиц старших возрастных групп зависит от ее пиковой массы, сформированной в молодом возрасте [2, 3]. Эти данные обусловливают повышенный интерес к проблеме развития патологии костной системы у подростков, которая является актуальной для современной педиатрии. Помимо наследственных факторов на формирование минеральной плотности костей оказывают влияние факторы внешней и внутренней среды [4]. С указанной позиции для своевременной диагностики ранних стадий заболеваний необходимы совершенствование биохимических методов оценки минеральной плотности костной массы у детей, отражающих процессы остеосинтеза и костной резорбции, а также исследование молекулярно-генетических маркеров. Это дает основание для поиска и идентификации генов – кандидатов предрасположенности к патологии костно-мышечной системы с помощью методов, которыми располагает молекулярная генетика на сегодняшний день. Также изучение взаимосвязей между биохимическими маркерами состояния костной системы и генами-кандидатами, участвующими в регуляции костного метаболизма и детерминирующими минеральную плотность костной ткани, вызывает обоснованный научный интерес. Подобные данные позволят более углубленно изучить патогенез нарушений костного метаболизма у подростков и тем самым назначить адекватную терапию, а значит, предупредить развитие патологии у лиц старших возрастных групп.
Обмен кальция и фосфатов костной ткани регулируется при участии витамина D путем взаимодействия его гормонально-активной формы кальцитриола 1,25(OH)2 D3 с рецепторами клеток. Рецептор к кальцийтриолу (витамину D, VDR) (или NR1I1) относится к семейству ядерных транскрипционных белков и принимает участие не только в процессе транскрипции, но и в механизме посттранскрипции, контролируемом микроРНК. В организме человека рецептор витамина D кодируется геном, локализованным в 12-й хромосоме (регион 12q13), который оказывает влияние на минеральную плотность костной ткани в организме и обусловленную развитием скелета длину тела [5–7]. Однако известно, что дефицит продукции гормонов щитовидной железы у детей приводит к прекращению роста и созреванию костей, тогда как тиреотоксикоз ускоряет эти процессы. А у взрослых тиреотоксикоз является важной и общепризнанной причиной вторичного остеопороза [8, 9].
Цель работы: изучить диагностическую значимость генетических (ген рецептора витамина D ) и биохимических маркеров (гормоны щитовидной железы) минерального метаболизма и в оценке состояния костной системы у подростков.
Материал и методы исследования. Изучено состояние здоровья 78 подростков (36 мальчиков и 42 девочек) в возрасте от 15 до 17 лет, учащихся общеобразовательных учреждений г. Владивостока. Распределение по группам здоровья проводили в соответствии с общепринятыми рекомендациями Института гигиены детей и подростков. Для оценки физиологических параметров состояния костно-мышечной системы использован метод активного интервью согласно разработанной индивидуальной карте. Для молекулярно-генетического анализа использованы образцы ДНК, извлеченные из лейкоцитов крови с помощью наборов для выделения «Экстра ДНК Био» («Алкор Био», Россия). Для определения полиморфных вариантов rs731236 c.1056 T/C гена внутриклеточного рецептора витамина D VDR методом ПЦР в реальном времени на амплификаторе модели PicoReal (США) использовали набор реагентов производства компании ООО «Генотехнология» (Россия).
Количественное выявление свободного тироксина в сыворотке крови проводили с помощью метода твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА, набор реагентов «ТироидИФА-свободный Т4», Россия). Регистрация оптической плотности исследованных образцов проводилась на приборе Multiskan FC версия ESW 1.00.96 (Thermo Scientific, США) с помощью программы «BiometraBDA/BioDocAnalyze» (Biometra, США). В методе использован вариант конкурентного твердофазного иммуноферментного анализа, при котором устанавливается равновесие между конъюгатом и свободным тироксином образца в процессе связывания с антителами, иммобилизированными на внутренней поверхности лунок планшета. Количество связанного антителами конъюгата обратно пропорционально количеству свободного тироксина в исследуемом образце, количество которого определяли на основании калибровочного графика. Аналогично было изучено содержание трийодтиронина («ТироидИФА-трийодтиронин», Россия) и тироксина в сыворотке крови (ТироидИФА-тироксин, Россия).
Методы статистической обработки, применяемые в работе для оценки достоверности результатов, проводились в Microsoft Excel с помощью сводных таблиц и описательных статистик из подключаемого пакета анализа Statistika 10.0 для персонального компьютера. Описательный анализ включал определение среднего арифметического значения, стандартного отклонения, ошибки среднего значения ( m ) при вычислении критерия [C1] Стьюдента. Для изучения влияния фактора на риск развития патологии костно-мышечной системы у подростков рассчитывали критерий Фишера ( F ) на основе четырехпольной таблицы сопряженности исходя из количества исследуемых. Использовали известные графические приемы для выражения статистических данных. Критический уровень значимости (р) при проверке статистических гипотез в исследовании принимался равным 0,05.
Результаты исследования и обсуждение. Согласно нашим данным из 78 человек в первую группу здоровья вошли всего два человека, остальные были отнесены ко второй (2,3% и 97,7% соответственно). Правильная осанка была выявлена у 63% детей, причем у мальчиков этот показатель преобладал и составлял 73% против 54% у девочек. Гиперкифоз наблюдался у девочек чаще, чем у мальчиков: 15% против 9%, так же как и выпрямленная осанка – 22% против 14%. Х-образная форма ног преобладала у девочек и встречалась в 25% случаев, а у мальчиков – в 19%.
Согласно генетическому тестированию обследуемые были распределены на группы соответственно распределению аллелей полиморфного маркера rs 731236 T/C гена внутриклеточного рецептора витамина D VDR на следующие генотипы: Т/С, С/C, T/T (табл. 1). Первую группу составили 52 человека (66,7%), вторую – 10 человек (12,8%), третью – 16 человек (20,5%).
Распределение полиморфизма гена рецептора витамина D ( VDR )
согласно возрасту и полу обследуемых
Распределение аллелей гена рецептора к витамину D
Источник
83 Ген рецептора витамина D (VDR). Выявление мутации A283G (BsmI)
В ходе исследования выполняется идентификация аллельного полиморфизма 283 A> G (BsmI) гена VDR. Название гена VDR является аббревиатурой Vitamin D Receptor (рецептор к витамину D). Белок, продуцируемый этим геном, относится к семейству ядерных рецепторов, активируя другие гены, включенные в метаболизм кальция. Витамин D, образующийся в коже под действием солнечных лучей, или попадающий в организм с пищей или в виде лекарственной формы, связывается с белком VDR. Этот комплекс транспортируется в ядра клеток и активирует гены, поддерживающие уровень кальция в крови на необходимом уровне. В гене VDR есть ряд других функциональных полиморфизмов (ApaI, TaqI, FokI, poly-A), которые также вносят определенный вклад в генетическую предрасположенность нарушения метаболизма кальция. Аллельные варианты в исследованной области гена: A (B или BsmI-) и G (b или BsmI+). В европейских популяциях оба аллеля встречаются примерно с равной частотой.