Определение витамина с краской тильманса

Пищевая химия: учебник для студентов вузов

Лабораторная работа 35. Титриметрические методы определения витамина С

Сущность титриметрического метода заключается в том, что 2, 6-дихлорфенолиндофенол выступает не только как окислитель, но и как индикатор, по которому определяют окончание титрования. Окраска раствора 2, 6-дихлорфенолиндофенола зависит от рН среды, а при восстановлении он переходит в лейкоформу.

Количественное определение ведут путем добавления к подкисленному раствору, содержащему витамин С, щелочного раствора краски Тильманса. Пока в титруемом растворе содержится витамин С, добавляемый раствор 2, 6-дихлорфенолиндофенола, имеющий глубокий синий цвет, обесцвечивается с образованием лейкоформы (индикатор), за счет присутствия восстановленной формы АК. Как только все количество АК в анализируемом растворе окислится до ДАК, раствор приобретает красную окраску, характерную для окисленной формы 2, 6-дихлорфенолиндофенола в кислой среде. Метод стандартизирован (ГОСТ 30627.2–98 – Методы измерений массовой доли витамина С (аскорбиновой кислоты).

Ход анализа . Точную навеску (около 5–10 г) предварительно измельченного исследуемого материала поместить в фарфоровую ступку. Небольшими порциями добавить 20 мл 1%-го раствора соляной кислоты, тщательно растирая пробу до получения однородной кашицы. Смесь количественно перенести в мерную колбу вместимостью 100 мл (общий объем соляной кислоты не должен превышать 50 мл). Ступку и пестик ополоснуть 1%-м раствором щавелевой кислоты и собрать смывы в ту же мерную колбу. Объем раствора довести до метки раствором щавелевой кислоты.

Содержимое колбы перемешать и через 5 минут отфильтровать через складчатый фильтр в сухую колбу или центрифугировать. Полученный фильтрат или фугат в количестве 1–10 мл (в зависимости от содержания витамина) отобрать пипеткой в коническую колбу и довести объем раствора дистиллированной водой до 15 мл. Анализируемый раствор оттитровать из микробюретки 0,001 н раствором 2, 6-дихлор-фенолиндофенола до появления розового окрашивания, не исчезающего в течение 30–60 с.

Контрольный опыт . Для оценки поправки на присутствие других редуцирующих веществ в используемых реагентах к 10 мл фильтрата или фугата прилить 0,1 мл 10%-го раствора сернокислой меди и выдержать при температуре 110 0 С в течение 10 минут для разложения АК. После охлаждения добавить 5 мл дистиллированной воды и оттитровать анализируемый раствор из микробюретки 0,001 н раствором 2, 6-дихлорфенолиндофенола. Для титруемого объема в 15 мл объем титранта, пошедшего на контрольный опыт, обычно составляет 0,04–0,06 мл. Эту поправку необходимо вычесть из объема титранта, пошедшего на титрование опытного образца. Рассчитать массовую долю аскорбиновой кислоты ( С АК , мг %) в анализируемом материале по формуле

C A K = T × V 1 × V 2 m × V 3 × 100 ,

где Т – титр 0,001 н раствора 2, 6-дихлорфенолиндофенола по аскорбиновой кислоте, 0,088 мг/мл;
V 1 – объем 0,001 н раствора 2, 6-дихлорфенолиндофенола, пошедшего на титрование экстракта с учетом поправки на реагенты, мл;
V 2 – общий объем экстракта, 100 мл;
V 3 – объем экстракта, взятого на титрование, 15 мл;
m – масса навески исследуемого материала, г;
100 – коэффициент пересчета на 100 г.

Определение витамина С в окрашенных растворах

Многие растительные материалы дают окрашенные экстракты, что затрудняет определение АК путем прямого титрования краской Тильманса. В этом случае титрование ведут в присутствии растворителей, которые сами нерастворимы в воде, но растворяют краску и не растворяют пигменты экстракта, таких как хлороформ или смесь толуола и изобутилового спирта (1:1).

Ход анализа . Точную навеску (около 5–10 г) растительного материала растереть в фарфоровой ступке в 20 мл 1%-ной соляной кислоты. Полученный гомогенат количественно перенести в мерную колбу вместимостью 100 мл и довести объем до метки 1%-ным раствором щавелевой кислоты. Соотношение соляной и щавелевой кислот должно составить 1:5. Содержимое колбы перемешать и через 5 минут отфильтровать через складчатый фильтр в сухую колбу.

В пробирку вместимостью 20 мл отмерить пипеткой 5 мл отфильтрованного окрашенного экстракта, добавить мерным цилиндром 5 мл хлороформа и оттитровать 0,001 н раствором 2, 6-дихлор-фенолиндофенола при осторожном перемешивании, наклоняя пробирку. Титрование прекратить при появлении красного окрашивания в слое хлороформа.

Для оценки поправки на реагенты приготовить контрольный раствор. В качестве контрольного раствора использовать 5 мл смеси из 1%-ных растворов соляной и щавелевой кислот (в соотношении объемов 1:5) и 5 мл хлороформа. Объем титранта, пошедший на контрольный опыт, необходимо вычесть из объема титранта, пошедшего на титрование опытного образца. Рассчитать массовую долю аскорбиновой кислоты ( С АК , мг %) по формуле

C A K = T × V 1 × V 2 m × V 3 × 100 ,

где Т – титр 0,001 н раствора 2, 6-дихлорфенолиндофенола по аскорбиновой кислоте, 0, 088 мг/мл;
V 1 – объем 0,001 н раствора 2, 6-дихлорфенолиндофенола, пошедшего на титрование экстракта с учетом поправки на контрольный опыт, мл;
V 2 – общий объем экстракта, 100 мл;
V 3 – объем экстракта, взятого на титрование, 5 мл;
m – масса навески исследуемого материала, г;
100 – коэффициент пересчета на 100 г.

Определение содержания витамина С в молочных продуктах

Содержание витамина С в сыром молоке зависит от времени года, индивидуальных особенностей животного и колеблется в интервале 0,3–2 мг%. В свежем молоке 67–68% приходится на восстановленную форму витамина С (АК) и 22–33% на окисленную (ДАК). Окисление витамина С в молоке катализирует аскорбатоксидаза и ускоряется в присутствии металлов (железа, меди), света, воздуха. Прямому определению АК в молоке препятствуют белки, способные связывать 2, 6-дихлорфенолиндофенол. В связи с этим определение АК ведут в безбелковом фильтрате. Белки осаждают с помощью насыщенного раствора хлорида натрия или раствора кислоты (метафосфорной, щавелевой, соляной).

Ход анализа . Навеску анализируемого молочного продукта (10 г) растворить 15–25 мл 6%-го раствора метафосфорной кислоты, количественно перенести в мерную колбу вместимостью 50 мл и довести объем смеси до метки тем же раствором кислоты (вместо метафосфорной кислоты можно использовать 2%-ный раствор соляной кислоты). Полученную смесь перемешать и отфильтровать. В коническую колбу для титрования отобрать пипеткой 1 мл фильтрата, довести объем до 15 мл дистиллированной водой и оттитровать из микробюретки 0,001 н раствором 2,6-дихлорфенолиндофенола до появления слаборозового окрашивания, не исчезающего в течение 30–60 с.

Рассчитать массовую долю аскорбиновой кислоты ( С АК , мг %) в анализируемом молоке по формуле

C A K = T × V 1 × V 2 m × V 3 × 100 ,

где Т – титр 0,001 н раствора 2, 6-дихлорфенолиндофенола по аскорбиновой кислоте, 0,088 мг/мл;
V 1 – объем 0,001 н раствора 2, 6-дихлорфенолиндофенола, пошедшего на титрование анализируемого образца с учетом поправки на реагенты, мл;
V 2 – общий объем раствора, 50 мл;
V 3 – объем раствора, взятого на титрование, 1 мл;
m – масса навески исследуемого материала, г;
100 – коэффициент пересчета в проценты.

Упрощенный йодатный метод определения витамина С в молоке

В основе йодатного метода лежит реакция окисления АК йодноватокислым калием до ДАК.

Определение витамина С упрощенным йодатным методом не применяют для анализа жидких концентратов из плодов шиповника, консервированных продуктов, свежеотжатых соков, свежих плодов, овощей, сушенных продуктов, витаминизированных чаев.

Ход анализа . Экстракцию витамина С провести с использованием 2%-го раствора соляной кислоты по методике, указанной выше. На анализ отобрать 1–5 мл экстракта (в зависимости от содержания витамина С) в коническую колбу вместимостью 100 мл, куда заранее добавить 0,5 мл 1%-го раствора йодистого калия, 1 мл 1%-го раствора крахмала и воды (3,5–7,5мл) с таким расчетом, чтобы общий объем смеси составил 10 мл. Полученный раствор оттитровать из микробюретки 0,001 н раствором йодноватокислого калия до появления устойчивого слабо синего окрашивания. Рассчитать содержание аскорбиновой кислоты ( С АК , мг %) в анализируемом молоке по формуле

C A K = T × V 1 × V 2 m × V 3 × 100 ,

где Т – титр 0,001 н раствора йодноватокислого калия по аскорбиновой кислоте, 0,088 мг/мл;
V 1 – объем 0,001 н раствора йодноватокислого калия, пошедшего на титрование анализируемого образца с учетом поправки на контрольный раствор, мл;
V 2 – общий объем экстракта, 1–5 мл;
V 3 – объем раствора, взятого на титрование, 10 мл;
m – масса навески исследуемого материала, г;
100 – коэффициент пересчета в проценты

Контрольный опыт . В коническую колбу отмерить 0,5 мл 1%-го раствора йодистого калия, 1 мл 1%-го раствора крахмала, 1 мл 2%-го раствора соляной кислоты и воды с таким расчетом, чтобы общий объем жидкости составил 10 мл, и оттитровать из микробюретки 0,001 н раствором йодноватокислого калия до появления устойчивого слабо синего окрашивания.

Необходимые реактивы, посуда, оборудование :

§ 1-, 2%-ные растворы соляной кислоты, 1%-ный раствор щавелевой кислоты, 6%-ный раствор метафосфорная кислота (Н n P n O 3n ), 10%-ный раствор сульфата меди, 2%-ный раствор серной кислоты, аскорбиновая кислота кристаллическая, 1%-ный раствор крахмала, 0,001 н раствор 2,6-дихлор-фенолиндофенола, аскорбиновая кислота кристаллическая, хлороформ, 1%-ный раствор йодистого калия, 0,001 н раствор йодноватокислого калия ( KJO 3 ), кристаллический йодид калия;

§ колбы для титрования, пипетки, микробюретки, фарфоровые ступки с пестиком, мерные колбы вместимостью 50 мл, 100 мл, делительные воронки, воронки для фильтрования, мерные цилиндры, пробирки;

§ аналитические весы, центрифуга, термостат на 110 0 С.

1%-ный раствор соляной кислоты . В мерную колбу вместимостью 1000 мл отмерить 23 мл соляной кислоты плотностью 1,185 г/мл, развести 300 мл дистиллированной воды и довести объем раствора до метки.

0,001 н раствор йодноватокислого калия ( KJO 3 ) . Навеску йодата калия 0,03568 г растворить в небольшом количестве дистиллированной воды в мерной колбе вместимость 1 л и довести объем раствора до метки.

0,001 н раствор 2,6-дихлорфенолиндофенола ( краска Тильманса ) . Навеску краски около 0,2 г растворить в 300 мл свежепрокипяченной теплой дистиллированной воды, добавить 20–30 капель 0,01 н раствора гидроксида калия или натрия и количественно перенеси в колбу вместимостью 1000 мл. Объем раствора довести до метки и отфильтровать. Титр раствора определить по йодноватокислому калию.

Определение титра раствора 2,6-дихлорфенолиндофенола по йодноватокислому калию. В мерной колбе вместимостью 50 мл растворить 1 мг кристаллической аскорбиновой кислоты в 30 мл раствора 2%-ной серной кислоты и довести объем до метки тем же раствором кислоты. В две конические колбы для титрования отобрать по 5 мл приготовленного раствора аскорбиновой кислоты. Раствор в одной колбе оттитровать 0,001 н раствором 2,6-дихлорфенолиндофенолом до появления розового окрашивания, не исчезающего в течение 30 с. Во вторую колбу добавить несколько кристалликов йодида калия (около 1–2 мг), 5 капель 1%-го раствора крахмала и оттитровать 0,001 н раствором йодноватокислого калия до появления едва заметного синего окрашивания.

Исходя из того, что 1 мл 0,001 н раствора йодноватокислого калия, а следовательно, и 2,6-дихлорфенолиндофенола, эквивалентен 0,088 мг аскорбиновой кислоты, рассчитать титр раствора 2,6–дихлор-фенолиндофенола ( Т, мг/мл) по аскорбиновой кислоте по формуле

T = 0 , 088 × V 1 V 2 ,

где 0,088 – количество аскорбиновой кислоты, соответствующее 1 мл 0,001 н раствора йодноватокислого калия, мг/мл;
V 1 – объем 0,001 н раствора йодата калия, израсходованного на титрование раствора аскорбиновой кислоты, мл;
V 2 – объем раствора 2,6-дихлорфенолиндофенола, израсходованное на титрование, мл.

Источник

Метод тильманса определения витамина с

Принцип метода. Методика основана на реакции восстановления

дихлорфенолиндофенола в кислой среде в присутствии аскорбиновой кислоты в лейкоформу. При этом аскорбиновая кислота окисляется в ди- гидроаскорбиновую. О завершении окислительно-восстановительного процесса свидетельствует появление розового окрашивания титруемого раствора после добавления очередной капли 2,6-дихлорфенолиндофенола.

1/15 М раствор дигидрофосфата калия (КН2РО4): 9,078 г КН2РО4 растворяют в небольшом количестве дистиллированной воды и доводят объем до 1 л дистиллированной водой.
1/15 М раствор гидрофосфата натрия (Ш^ОТО^: 11,876 г кристаллогидрата Na2HP04x2H20 растворяют в небольшом количестве дистиллированной воды и доводят объем до 1 л дистиллированной водой.
0,1 н. раствор серной кислоты (И^О4).
2 М раствор соляной кислоты.
Насыщенный раствор оксалата аммония: 10 г сухого реактива заливают 100 мл дистиллированной воды при комнатной температуре, перемешивают до растворения.
50% раствор серной кислоты (И^О4): концентрированную серную кислоту (относительная плотность 1,84) разводят дистиллированной водой в соотношении 1:2.
0,01 н. раствор оксалата натрия (Na2C^4) для проверки титра 0,01 н. раствора перманганата калия (КМпО4). Ввиду того, что соль гигроскопична, ее необходимо поместить на несколько часов в эксикатор с концентрированной серной кислотой, бюкс или чашечку с реактивом оставляют открытой. Для приготовления 0,1 н. раствора берут не менее

3 навесок. Используют свежеприготовленный раствор. Навески в количестве 67 мг переносят в мерные колбы на 100 мл, растворяют в би- дистиллированной воде, доводят объем до метки, перемешивают.

0,01 н. раствор перманганата калия (КМпО4): готовят из фиксанала или берут навеску в количестве 316 мг, которую растворяют в мерной колбе на 1 л сначала в небольшом количестве дистиллированной воды (200300 мл), а затем доводят объем до метки и тщательно перемешивают. До проверки титра реактив необходимо выдержать 10-14 дней, поскольку в свежеприготовленном растворе титр неустойчив.
0,001 н. раствор 2,6-дихлорфенолиндофенола (краска Тильманса). Готовят более концентрированный раствор краски Тильманса, так как реактив неустойчив при хранении: 0,3 г 2,6-дихлорфенолиндофенола растворяют в 500 мл горячей дистиллированной воды, энергично взбалты
вают и оставляют на несколько часов или до следующего дня для лучшего растворения. В целях удлинения срока хранения к краске Тиль- манса прибавляют 120 мл 1/15 М раствора дигидрофосфата калия (КН2РО4) и 180 мл 1/15 М раствора гидрофосфата натрия (Ка2ИРО4), перемешивают и доводят объем дистиллированной водой до 1 л. Тщательно перемешивают и фильтруют. Приготовленную таким образом краску Тильманса можно хранить в течение 12-14 дней в посуде из темного стекла на холоде. В дни проведения исследований титр 2,6- дихлорфенолиндофенола обязательно уточняют по 0,01 н. раствору соли Мора.

10.0,01 н. раствор соли Мора: навеску сухой соли Мора — 392 мг — переносят в мерную колбу на 100 мл и добавляют 5 мл 0,1 н. раствора серной кислоты, растворяют и доводят объем дистиллированной водой до метки. Содержимое колбы тщательно перемешивают. Хранят в посуде из темного стекла на холоде.

Проверка титров реактивов:

0,01 н. раствор перманганата калия (КМпО4): в колбу на 50 мл вносят 10 мл 0,01 н. раствора оксалата натрия и 2,5 мл 50% раствора серной кислоты, перемешивают и нагревают на водяной бане почти до кипения. Затем титруют 0,01 н. раствором перманганата калия до появления слабо-розовой окраски, не исчезающей в течение 30 сек. Коэффициент поправки для 0,01 н. раствора перманганата калия рассчитывают по формуле:

а — навеска оксалата натрия, г;

— объем 0,01 н. раствора перманганата калия, израсходованного на титрование, мл;

067 — количество раствора оксалата натрия (№2СаО4), соответствующее 1 мл 0,01 н. раствора перманганата калия (КМпО4), мл.

0,01 н. раствор соли Мора: в колбу на 50 мл отбирают 10 мл раствора соли Мора, доливают 1,5 мл 50% раствора серной кислоты (И2БО4), перемешивают и титруют 0,01 н. раствором перманганата калия (КМпО4) до стойкого слабо-розового окрашивания, не исчезающего в течение 30 с. Поправку к титру соли Мора (K1) рассчитывают по формуле:

тл V х К К1 = , где

— объем 0,01 н. раствора перманганата калия, пошедшего на титрование, мл;

10 — объем соли Мора, мл;

К — коэффициент поправки для 0,01 н. раствора перманганата калия (КМпО4).

Краска Тильманса: в пробирку Хагедорна отбирают 10 мл 0,001 н. раствора 2,6-дихлорфенолиндофенола, добавляют 5 мл насыщенного раствора оксалата аммония и титруют 0,01 н. раствором соли Мора до изменения синей окраски на соломенно-желтую (нерезкая перемена окраски указывает на непригодность краски Тильманса). Коэффициент поправки для краски Тильманса рассчитывают по формуле:

— объем раствора соли Мора, пошедшего на титрование, мл;

K1 — коэффициент поправки к титру соли Мора.

В пробирку Хагедорна отбирают 5 мл мочи, приливают 10 мл дистиллированной воды, перемешивают и подкисляют мочу 2% раствором соляной кислоты.
Титруют 0,001 н. раствором 2,6-дихлорфенолиндофенола до появления слабо-розового окрашивания, не исчезающего в течение 30 с. Титровать рекомендуется при дневном освещении, используя белый фон. Для того чтобы точнее уловить момент окончания титрования, ставят параллельные пробы для сравнения окраски.

Расчет содержания аскорбиновой кислоты в суточном объеме мочи ведут по формуле:

Tjr К 2 X а x 0,088 xV Х = ^ , где

Х — содержание аскорбиновой кислоты, мг;

а — количество 0,001 н. раствора 2,6-дихлорфенолиндофенола, пошедшего на титрование 5 мл мочи, мл;

К2 — коэффициент поправки к титру краски Тильманса;

088 — количество аскорбиновой кислоты, восстанавливающее 1 мл краски Тильманса, мг;

— суточный объем мочи, мл;

5 — объем мочи, взятой для исследования, мл.

В норме суточная экскреция аскорбиновой кислоты у практически здоровых людей составляет 30-40 мг/сут, или 0,11-0,22 ммоль/сут.

Определение аскорбиновой кислоты в сыворотке крови по

Принцип метода. Методика основана на реакции восстановления

дихлорфенолиндофенола в кислой среде в присутствии аскорбиновой кислоты в лейкоформу. При этом аскорбиновая кислота окисляется в ди- гидроаскорбиновую. О завершении окислительно-восстановительного процесса свидетельствует появление розового окрашивания титруемого
раствора после прибавления очередной капли 2,6-дихлорфенолиндо- фенола.

Те же, что и для определения аскорбиновой кислоты в моче и дополнительно:

0,0005 н. раствор краски Тильманса: готовят из 0,001 н. раствора 2,6- дихлорфенолиндофенола разведением дистиллированной водой в соотношении 1:1.
20% раствор трихлоруксусной кислоты (ТХУ).

Берут 1 мл сыворотки крови и медленно приливают 2,5 мл 20% раствора ТХУ, встряхивая пробу, добавляют 2,5 мл дистиллированной воды, смешивают. Белки крови при этом осаждаются. Через 30 мин центрифугируют в течение 5 мин при 3000 об./мин. Надосадочную жидкость сливают в пробирку Хагедорна и титруют 0,0005 н. раствором 2,6- дихлорфенолиндофенола до слабо-розовой окраски, не исчезающей в течение 30 с.

Расчет содержания аскорбиновой кислоты в сыворотке крови ведут по формуле:

„ К х а х 0,088 х100

Х — содержание аскорбиновой кислоты, мг/дл;

а — количество 0,0005 н. раствора 2,6-дихлорфенолиндофенола, пошедшего на титрование 1 мл сыворотки крови, мл;

К — коэффициент поправки к титру краски Тильманса;

088 — количество аскорбиновой кислоты, восстанавливающее 1 мл краски Тильманса, мг;

2 — разведение краски Тильманса;

100 — расчет на 100 мл сыворотки крови.

Коэффициент для перевода концентрации аскорбиновой кислоты в сыворотке крови из мг/дл в мкмоль/л — 5,678.

В норме содержание аскорбиной кислоты в крови составляет 40-114 мкмоль/л, или 0,7-2,0 мг/дл; в плазме — 40-70 мкмоль/л, или 0,7-1,2 мг/дл.

Определение тиамина (витамина В1) в моче по Вангу и Харрису

Принцип метода: Определение тиамина основано на его окислении в тиохром красной кровяной солью в щелочной среде с последующим извлечением тиохрома изобутиловым спиртом и измерением флюоресценции.

20% раствор гидроксида натрия (NaOH).
10% раствор красной кровяной соли [K3Fe(CN)6] квалификации х.ч. или

ч.д.а. Раствор готовят непосредственно перед исследованием.

96% этиловый спирт.
Спирт изобутиловый или изоамиловый. Все спирты, используемые в методике, должны быть очищены от флюоресцирующих примесей перегонкой или обработкой активированным углем (температура кипения изобутилового спирта 108°С, изоамилового — 123-130°С).
0,1 М раствор соляной кислоты (НС1).
Основной стандартный раствор витамина В1 с содержанием тиамина 100 мкг/мл: 10 мг тиамина вносят в мерную колбу на 100 мл, растворяют в 0,1 М растворе соляной кислоты и доводят объем до метки. Хранят в холодильнике в посуде из темного стекла, пригоден в течение 4-6 мес.
Рабочие стандартные растворы с содержанием тиамина 1-5 мкг/мл: готовят в день проведения исследования из основного стандартного раствора соответствующим разведением 0,1 М раствором соляной кислоты. Например, для получения рабочего раствора с содержанием тиамина 2 мкг/мл в мерную колбу на 100 мл вносят 2 мл основного стандартного раствора (абсолютное содержание тиамина — 200 мкг) и доводят объем до метки 0,1 М раствором соляной кислоты, тщательно перемешивают. Рабочий стандартный раствор пригоден для использования в течение 4

дней. Хранят в холодильнике.

Определение содержания тиамина осуществляют на флюориметре.

В пробирки с пришлифованными пробками вносят по 5 мл мочи, такой же объем изобутилового или изоамилового спирта и встряхивают интенсивно в течение 2 мин. Моча при этом очищается от посторонних флюоресцирующих примесей.

После расслоения верхний спиртовой слой удаляют отсасыванием с помощью водоструйного насоса.

В две пробирки со стеклянными притертыми пробками вносят по 1 мл очищенной мочи. Одна из них будет служить контролем (К) на наличие в моче не удаленных флюоресцирующих примесей, другая опытом (О) для определения концентрации тиамина в моче.

В пробирку с обозначением “К” вносят 1 мл 20% раствора гидроксида натрия и встряхивают.

В пробирку с обозначением “О” вносят 1 мл 20% раствора гидроксида натрия, встряхивают и немедленно по каплям при постоянном перемешивании добавляют свежеприготовленный 10% раствор красной кровяной соли до появления желтоватой окраски, не исчезающей в течение 30 с, что обусловлено окислением тиамина в тиохром.

Параллельно с серией опытов готовят серию стандартных проб (Ст), в которые вносят по 1 мл стандартных растворов с содержанием тиамина

5 мкг/мл, добавляют по 1 мл 20% раствора гидроксида натрия и по каплям до появления желтой окраски — 10% раствор красной кровяной соли.

Для того чтобы учесть наличие посторонний флюоресцирующих примесей в реактивах, необходимо поставить контрольную пробу к стандартному раствору (Кст). Для этого берут 1 мл дистиллированной воды, прибавляют 1 мл 20% раствора гидроксида натрия и 1-2 капли 10% раствора красной кровяной соли.

Во все пробирки с обозначениями “О”, “К”, “Ст” и “Кст” добавляют по 5 мл дистиллированной воды, перемешивают и приливают по 7 мл изо- бутилового или изоамилового спирта энергично встряхивают в течение 2 мин (одновременно проводят обработку нескольких пробирок). Ставят в темное место для расслоения.

После расслоения отсасывают по 5 мл верхнего спиртового слоя с извлеченным тиохромом в химические пробирки, в которые предварительно наливают по 1 мл этилового спирта для просветления, раствора и смешивают. Отсасывание следует начинать с контрольных пробирок используя предназначенную для этого пипетку.

Интенсивность флюоресценции измеряют на флюориметре. Флюориметр настраивают по стандартному раствору, наиболее близко совпадающему по показаниям с исследуемой мочой. Как правило, берут стандарт концентрацией 2 мкг/мл и 4 мкг/мл и устанавливают соответственно на 40 и 80 делений.

Измеряют флюоресценцию опытных, стандартных и контрольных

Расчет содержания тиамина в суточном количестве мочи проводят по формуле:

X — содержание тиамина в моче, мкг/сут;

С — концентрация тиамина в стандартном растворе, нмоль/мл (мкг/мл);

О — показание флюориметра для опытной пробы мочи;

К — показание флюориметра для контрольной пробы мочи; а — показание флюориметра для стандартного раствора;

Кст — показание флюориметра для контрольной пробы на реактивы;

Коэффициент для перевода содержания тиамина в моче из мкг/сут в нмоль/сут составляет 2,965.

В норме суточное содержание витамина В1 в моче составляет 4441480 нмоль (150-500 мкг); часовое натощак — 44,5-88,9 нмоль (15-30 мкг).

Содержание свободного тиамина в плазме крови — 30-45 нмоль/л (11,5 мкг/дл).

Ход анализа. Точную навеску (около 5–10 г) предварительно измельченного исследуемого материала поместить в фарфоровую ступку. Небольшими порциями добавить 20 мл 1%-го раствора соляной кислоты, тщательно растирая пробу до получения однородной кашицы. Смесь количественно перенести в мерную колбу вместимостью 100 мл (общий объем соляной кислоты не должен превышать 50 мл). Ступку и пестик ополоснуть 1%-м раствором щавелевой кислоты и собрать смывы в ту же мерную колбу. Объем раствора довести до метки раствором щавелевой кислоты.

Контрольный опыт. Для оценки поправки на присутствие других редуцирующих веществ в используемых реагентах к 10 мл фильтрата или фугата прилить 0,1 мл 10%-го раствора сернокислой меди и выдержать при температуре 110 0С в течение 10 минут для разложения АК. После охлаждения добавить 5 мл дистиллированной воды и оттитровать анализируемый раствор из микробюретки 0,001 н раствором 2, 6-дихлорфенолиндофенола. Для титруемого объема в 15 мл объем титранта, пошедшего на контрольный опыт, обычно составляет 0,04–0,06 мл. Эту поправку необходимо вычесть из объема титранта, пошедшего на титрование опытного образца. Рассчитать массовую долю аскорбиновой кислоты (САК, мг %) в анализируемом материале по формуле

где Т – титр 0,001 н раствора 2, 6-дихлорфенолиндофенола по аскорбиновой кислоте, 0,088 мг/мл;
V1 – объем 0,001 н раствора 2, 6-дихлорфенолиндофенола, пошедшего на титрование экстракта с учетом поправки на реагенты, мл;
V2 – общий объем экстракта, 100 мл;
V3 – объем экстракта, взятого на титрование, 15 мл;
m – масса навески исследуемого материала, г;
100 – коэффициент пересчета на 100 г.

Определение витамина С в окрашенных растворах

Ход анализа. Точную навеску (около 5–10 г) растительного материала растереть в фарфоровой ступке в 20 мл 1%-ной соляной кислоты. Полученный гомогенат количественно перенести в мерную колбу вместимостью 100 мл и довести объем до метки 1%-ным раствором щавелевой кислоты. Соотношение соляной и щавелевой кислот должно составить 1:5. Содержимое колбы перемешать и через 5 минут отфильтровать через складчатый фильтр в сухую колбу.

где Т – титр 0,001 н раствора 2, 6-дихлорфенолиндофенола по аскорбиновой кислоте, 0, 088 мг/мл;
V1 – объем 0,001 н раствора 2, 6-дихлорфенолиндофенола, пошедшего на титрование экстракта с учетом поправки на контрольный опыт, мл;
V2 – общий объем экстракта, 100 мл;
V3 – объем экстракта, взятого на титрование, 5 мл;
m – масса навески исследуемого материала, г;
100 – коэффициент пересчета на 100 г.

Определение содержания витамина С в молочных продуктах

Ход анализа. Навеску анализируемого молочного продукта (10 г) растворить 15–25 мл 6%-го раствора метафосфорной кислоты, количественно перенести в мерную колбу вместимостью 50 мл и довести объем смеси до метки тем же раствором кислоты (вместо метафосфорной кислоты можно использовать 2%-ный раствор соляной кислоты). Полученную смесь перемешать и отфильтровать. В коническую колбу для титрования отобрать пипеткой 1 мл фильтрата, довести объем до 15 мл дистиллированной водой и оттитровать из микробюретки 0,001 н раствором 2,6-дихлорфенолиндофенола до появления слаборозового окрашивания, не исчезающего в течение 30–60 с.

Рассчитать массовую долю аскорбиновой кислоты (САК, мг %) в анализируемом молоке по формуле

где Т – титр 0,001 н раствора 2, 6-дихлорфенолиндофенола по аскорбиновой кислоте, 0,088 мг/мл;
V1 – объем 0,001 н раствора 2, 6-дихлорфенолиндофенола, пошедшего на титрование анализируемого образца с учетом поправки на реагенты, мл;
V2 – общий объем раствора, 50 мл;
V3 – объем раствора, взятого на титрование, 1 мл;
m – масса навески исследуемого материала, г;
100 – коэффициент пересчета в проценты.

Упрощенный йодатный метод определения витамина С в молоке

В основе йодатного метода лежит реакция окисления АК йодноватокислым калием до ДАК.

Ход анализа. Экстракцию витамина С провести с использованием 2%-го раствора соляной кислоты по методике, указанной выше. На анализ отобрать 1–5 мл экстракта (в зависимости от содержания витамина С) в коническую колбу вместимостью 100 мл, куда заранее добавить 0,5 мл 1%-го раствора йодистого калия, 1 мл 1%-го раствора крахмала и воды (3,5–7,5мл) с таким расчетом, чтобы общий объем смеси составил 10 мл. Полученный раствор оттитровать из микробюретки 0,001 н раствором йодноватокислого калия до появления устойчивого слабо синего окрашивания. Рассчитать содержание аскорбиновой кислоты (САК, мг %) в анализируемом молоке по формуле

где Т – титр 0,001 н раствора йодноватокислого калия по аскорбиновой кислоте, 0,088 мг/мл;
V1 – объем 0,001 н раствора йодноватокислого калия, пошедшего на титрование анализируемого образца с учетом поправки на контрольный раствор, мл;
V2 – общий объем экстракта, 1–5 мл;
V3 – объем раствора, взятого на титрование, 10 мл;
m – масса навески исследуемого материала, г;
100 – коэффициент пересчета в проценты

Контрольный опыт. В коническую колбу отмерить 0,5 мл 1%-го раствора йодистого калия, 1 мл 1%-го раствора крахмала, 1 мл 2%-го раствора соляной кислоты и воды с таким расчетом, чтобы общий объем жидкости составил 10 мл, и оттитровать из микробюретки 0,001 н раствором йодноватокислого калия до появления устойчивого слабо синего окрашивания.

Необходимые реактивы, посуда, оборудование:

§1-, 2%-ные растворы соляной кислоты, 1%-ный раствор щавелевой кислоты, 6%-ный раствор метафосфорная кислота (НnPnO3n), 10%-ный раствор сульфата меди, 2%-ный раствор серной кислоты, аскорбиновая кислота кристаллическая, 1%-ный раствор крахмала, 0,001 н раствор 2,6-дихлор-фенолиндофенола, аскорбиновая кислота кристаллическая, хлороформ, 1%-ный раствор йодистого калия, 0,001 н раствор йодноватокислого калия (KJO3), кристаллический йодид калия;

§колбы для титрования, пипетки, микробюретки, фарфоровые ступки с пестиком, мерные колбы вместимостью 50 мл, 100 мл, делительные воронки, воронки для фильтрования, мерные цилиндры, пробирки;

§аналитические весы, центрифуга, термостат на 110 0С.

1%-ный раствор соляной кислоты. В мерную колбу вместимостью 1000 мл отмерить 23 мл соляной кислоты плотностью 1,185 г/мл, развести 300 мл дистиллированной воды и довести объем раствора до метки.

0,001 н раствор йодноватокислого калия (KJO3). Навеску йодата калия 0,03568 г растворить в небольшом количестве дистиллированной воды в мерной колбе вместимость 1 л и довести объем раствора до метки.

0,001 н раствор 2,6-дихлорфенолиндофенола (краска Тильманса). Навеску краски около 0,2 г растворить в 300 мл свежепрокипяченной теплой дистиллированной воды, добавить 20–30 капель 0,01 н раствора гидроксида калия или натрия и количественно перенеси в колбу вместимостью 1000 мл. Объем раствора довести до метки и отфильтровать. Титр раствора определить по йодноватокислому калию.

Исходя из того, что 1 мл 0,001 н раствора йодноватокислого калия, а следовательно, и 2,6-дихлорфенолиндофенола, эквивалентен 0,088 мг аскорбиновой кислоты, рассчитать титр раствора 2,6–дихлор-фенолиндофенола (Т, мг/мл) по аскорбиновой кислоте по формуле

где 0,088 – количество аскорбиновой кислоты, соответствующее 1 мл 0,001 н раствора йодноватокислого калия, мг/мл;
V1 – объем 0,001 н раствора йодата калия, израсходованного на титрование раствора аскорбиновой кислоты, мл;
V2 – объем раствора 2,6-дихлорфенолиндофенола, израсходованное на титрование, мл.

Источник