ГОСТ 34151-2017 Продукты пищевые. Определение витамина С с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии
Текст ГОСТ 34151-2017 Продукты пищевые. Определение витамина С с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии
Определение витамина C с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии
Foodstuffs. Determination of vitamin С by high performance liquid chromatography
Дата введения 2019-01-01
Предисловие
Цели, основные принципы и основной порядок проведения работ по межгосударственной стандартизации установлены в ГОСТ 1.0-2015 «Межгосударственная система стандартизации. Основные положения» и ГОСТ 1.2-2015 «Межгосударственная система стандартизации. Стандарты межгосударственные, правила и рекомендации по межгосударственной стандартизации. Правила разработки, принятия, обновления и отмены»
Сведения о стандарте
1 РАЗРАБОТАН Федеральным государственным бюджетным учреждением науки Институтом физиологии растений им.К.А.Тимирязева Российской академии наук (ИФР РАН) и Федеральным государственным бюджетным научным учреждением «Всероссийский научно-исследовательский институт технологии консервирования» (ФГБНУ «ВНИИТеК»)
2 ВНЕСЕН Федеральным агентством по техническому регулированию и метрологии
3 ПРИНЯТ Межгосударственным советом по стандартизации, метрологии и сертификации (протокол от 1 июня 2017 г. N 51)
За принятие проголосовали:
Краткое наименование страны по МК (ИСО 3166) 004-97
Код страны по
МК (ИСО 3166) 004-97
Сокращенное наименование национального органа по стандартизации
Минэкономики Республики Армения
Госстандарт Республики Беларусь
4 Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 2 августа 2017 г. N 787-ст межгосударственный стандарт ГОСТ 34151-2017 введен в действие в качестве национального стандарта Российской Федерации с 1 января 2019 г.
5 ВВЕДЕН ВПЕРВЫЕ
6 В настоящем стандарте учтены основные положения BS EN 14130:2003* «Продукты пищевые. Определение витамина C с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии» («Foodstuffs. Determination of vitamin С by HPLC»)
________________
* Доступ к международным и зарубежным документам, упомянутым в тексте, можно получить, обратившись в Службу поддержки пользователей. — .
Информация об изменениях к настоящему стандарту публикуется в ежегодном информационном указателе «Национальные стандарты», а текст изменений и поправок — в ежемесячном информационном указателе «Национальные стандарты». В случае пересмотра (замены) или отмены настоящего стандарта соответствующее уведомление будет опубликовано в ежемесячном информационном указателе «Национальные стандарты». Соответствующая информация, уведомление и тексты размещаются также в информационной системе общего пользования — на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет (www.gost.ru)
1 Область применения
Настоящий стандарт устанавливает метод определения витамина C в пищевых продуктах с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ).
Содержание витамина C определяется в виде суммы L(+)-аскорбиновой и L(+)-дегидроаскорбиновой кислот.
2 Нормативные ссылки
В настоящем стандарте использованы нормативные ссылки на следующие межгосударственные стандарты:
ГОСТ 12.1.004-91 Система стандартов безопасности труда. Пожарная безопасность. Общие требования
ГОСТ 12.1.007-76 Система стандартов безопасности труда. Вредные вещества. Классификация и общие требования безопасности
ГОСТ 12.1.019-79* Система стандартов безопасности труда. Электробезопасность. Общие требования и номенклатура видов защиты
________________
* В Российской Федерации действует ГОСТ Р 12.1.019-2009.
ГОСТ OIML R 76-1-2011 Государственная система обеспечения единства измерений. Весы неавтоматического действия. Часть 1. Метрологические и технические требования. Испытания
ГОСТ 1770-74 (ИСО 1042-83, ИСО 4788-80) Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Общие технические условия
ГОСТ ISO 3696-2013** Вода для лабораторного анализа. Технические требования и методы контроля
________________
** В Российской Федерации действует ГОСТ Р 52501-2005 (ИСО 3696:1987) «Вода для лабораторного анализа. Технические условия».
ГОСТ ISO 5725-2-2003*** Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 2. Основной метод определения повторяемости и воспроизводимости стандартного метода измерений
________________
*** В Российской Федерации действует ГОСТ Р ИСО 5725-2-2002.
ГОСТ ISO 7886-1-2011 Шприцы инъекционные однократного применения стерильные. Часть 1. Шприцы для ручного использования
ГОСТ 25336-82 Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры
ГОСТ 29227-91 (ИСО 835-1-81) Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки градуированные. Часть 1. Общие требования
Примечание — При пользовании настоящим стандартом целесообразно проверить действие ссылочных стандартов в информационной системе общего пользования — на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет или по ежегодному информационному указателю «Национальные стандарты», который опубликован по состоянию на 1 января текущего года, и по выпускам ежемесячного информационного указателя за текущий год. Если ссылочный стандарт заменен (изменен), то при пользовании настоящим стандартом следует руководствоваться заменяющим (измененным) стандартом. Если ссылочный стандарт отменен без замены, то положение, в котором дана ссылка на него, применяется в части, не затрагивающей эту ссылку.
3 Сущность метода
Метод основан на экстракции витамина C из пробы раствором метафосфорной кислоты, с последующим восстановлением L(+)-дегидроаскорбиновой кислоты до L(+)-аскорбиновой кислоты и определением общего содержания L(+)-аскорбиновой кислоты с применением высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) со спектрофотометрическим детектированием при длине волны 265 нм.
4 Реактивы
4.1 Общие положения
При проведении определений, если не оговорены другие условия, используют только реактивы установленной аналитической чистоты и воду не ниже первой степени чистоты по ГОСТ ISO 3696.
4.2 Реактивы и растворы
4.2.1 Кислота метафосфорная (HPO ) .
4.2.2 Натрий фосфат трехзамещенный 12-водный Na PO ·12H O с массовой долей основного вещества не менее 98,0%.
4.2.3 Калий фосфат однозамещенный (дигидрофосфат) KH PO с массовой долей не менее 99,0%.
4.2.4 L-цистеин C H NO S с массовой долей не менее 99,0%.
4.2.5 N-цетил-N,N,N-триметиламмонийбромид (цетримид) C H BrN с массовой долей не менее 99,0%.
4.2.6 Метанол (для ВЭЖХ) с массовой долей не менее 99,0%.
4.2.7 Кислота метафосфорная, раствор массовой концентрации [(HPO ) ]=200 г/дм
200 г метафосфорной кислоты (см. 4.2.1) растворяют в воде в мерной колбе вместимостью 1 дм , объем содержимого в колбе доводят водой до метки.
Срок годности раствора — 1 мес при температуре 4°С.
4.2.8 Кислота метафосфорная, раствор массовой концентрации [(HPO ) ]=20 г/дм
50 см раствора метафосфорной кислоты, приготовленной по 4.2.7, переносят пипеткой в мерную колбу вместимостью 500 см , объем содержимого в колбе доводят водой до метки.
Раствор готовят в день проведения определения.
4.2.9 Натрий фосфорнокислый трехзамещенный, раствор массовой концентрации (Na PO4·12H O)=200 г/дм
200 г фосфорнокислого натрия трехзамещенного (см. 4.2.2) растворяют в воде в мерной колбе вместимостью 1 дм , объем содержимого в колбе доводят водой до метки.
L-цистеин, раствор массовой концентрации (C H NO S)=40 г/дм
20 г L-цистеина (см. 4.2.4) растворяют в воде в мерной колбе вместимостью 500 см , объем содержимого в колбе доводят водой до метки.
Раствор готовят в день проведения определения.
4.2.11 Фаза подвижная для ВЭЖХ
13,6 г дигидрофосфата калия (см. 4.2.3) растворяют в стакане в 900 см воды. Раствор фильтруют через мембранный фильтр с размером пор 0,45 мкм (раствор A).
1,82 г N-цетил-N,N,N-триметиламмонийбромида (см. 4.2.5) растворяют в стакане в 100 см метанола (см. 4.2.6). Полученный раствор фильтруют через мембранный фильтр с размером пор 0,45 мкм (раствор B).
Смешивают 900 см раствора A и 100 см раствора B. Полученную подвижную фазу для ВЭЖХ при необходимости перед употреблением дегазируют.
4.2.12 Крахмал (применяют по выбору пользователя), раствор массовой концентрации 1 г/100 см .
4.2.13 Йод (применяют по выбору пользователя), раствор молярной концентрации с(l )=0,05 моль/дм .
4.2.14 Кислота серная, раствор молярной концентрации с(H SO )=0,1 моль/дм .
4.3 Стандартные вещества
4.3.1 Кислота аскорбиновая (или L(+)-аскорбиновая) с массовой долей w(C H O ) не менее 99,7%
4.3.2 Кислота эриторбовая (изоаскорбиновая), D(-)-аскорбиновая с массовой долей ?=w(C H O ) не менее 99,0%
4.4 Основные стандартные растворы
4.4.1 Основной стандартный раствор аскорбиновой кислоты массовой концентрации ( C H O )=1 мг/см
Растворяют около 100 мг аскорбиновой кислоты (см. 4.3.1), взятой с точностью до 0,1 мг, в 100 см раствора метафосфорной кислоты, приготовленной по 4.2.8.
Раствор готовят в день проведения определения.
Для увеличения срока хранения основного раствора аскорбиновой кислоты добавляют L-цистеин.
4.4.2 Основной стандартный раствор эриторбовой (изоаскорбиновой) кислоты массовой концентрации ( C H O )=1 мг/см
Растворяют около 100 мг изоаскорбиновой кислоты (см. 4.3.2), взятой с точностью до 0,1 мг, в 100 см раствора метафосфорной кислоты, приготовленной по 4.2.8.
Раствор готовят в день проведения определения.
4.4.3 Вычисление точной концентрации основного стандартного раствора (выполняют по выбору пользователя)
Взвешивают в конической колбе около 150 мг аскорбиновой кислоты, добавляют 10 см раствора серной кислоты (см. 4.2.14) и 80 см воды, не содержащей диоксида углерода. После добавления раствора крахмала (см. 4.2.12) титруют раствором йода (см. 4.2.13) до появления устойчивой синей окраски. Масса аскорбиновой кислоты, эквивалентная 1 см раствора йода, пошедшего на титрование, составляет 8,81 мг.
Массовую долю основного компонента в стандартном веществе , %, вычисляют по формуле
, (1)
где — объем раствора йода, пошедший на титрование, см ;
8,81 — масса аскорбиновой кислоты, эквивалентная 1 см раствора йода, пошедшего на титрование, мг;
100 — коэффициент пересчета результата в проценты;
— масса навески стандартного вещества, мг.
4.5 Градуировочные растворы
4.5.1 Градуировочные растворы аскорбиновой кислоты с массовой концентрацией (C H O ) от 5 до 50 мкг/см
От 0,5 до 5 см основного раствора аскорбиновой кислоты, приготовленного по 4.4.1, переносят пипеткой в мерные колбы вместимостью 100 см , объем содержимого в колбах доводят до метки раствором метафосфорной кислоты, приготовленным по 4.2.8.
Растворы готовят в день проведения определения.
4.5.2 Градуировочный раствор эриторбовой (изоаскорбиновой) кислоты с массовой концентрацией (C H O )=10 мкг/см (готовят по выбору пользователя)
1 см основного раствора изоаскорбиновой кислоты, приготовленного по 4.4.2, переносят пипеткой в мерную колбу вместимостью 100 см , объем содержимого в колбе доводят до метки раствором метафосфорной кислоты, приготовленным по 4.2.8. Концентрация приготовленного раствора должна быть в пределах от 5 до 20 мкг/см .
Раствор готовят в день проведения определения.
Допускается применение других химических реактивов по качеству не ниже вышеуказанных.
5 Средства измерений, вспомогательное оборудование и посуда
5.1 Общие положения
Используют обычные приборы и оборудование.
5.2 Спектрофотометр с рабочим спектральным диапазоном в ультрафиолетовой области, пригодный для измерения оптической плотности при требуемых длинах волн, с комплектом кювет.
5.3 Хроматограф жидкостный
ВЭЖХ-система, состоящая из насоса, устройства ввода пробы, спектрофотометрического детектора, пригодного для измерения оптической плотности при длине волны 265 нм и компьютерной системы сбора и обработки данных.
5.4 Колонка для ВЭЖХ разделения
5.4.1 Общие положения
Допускается применение колонки с другим размером частиц сорбента или размерами колонки, по отношению к тем, что указаны в настоящем стандарте. Критерием пригодности колонки является разделение пиков L-аскорбиновой и изоаскорбиновой кислот на уровне базовой (горизонтальной) линии.
5.4.2 Параметры хроматографической колонки
Колонка с внутренним диаметром 4,0 мм, длиной 250 мм, заполненная сорбентом* на основе силикагеля с привитыми группами C размером частиц сорбента 5 мкм.
________________
* Lichrospher 100 RP 18 является примером подходящего сорбента. Данная информация приведена для удобства пользователей настоящего стандарта и не является рекламой этого продукта.
5.5 Устройство для фильтрации
Мембранный фильтр с размером пор, например, 0,2 или 0,45 мкм. Фильтрование подвижной фазы и раствора пробы перед использованием или вводом в хроматограф продлевает срок службы колонки.
5.6 Весы неавтоматического действия специального класса точности по ГОСТ OIML R 76-1 пределом допускаемой абсолютной погрешности ±0,001 г.
5.7 Иономер (рН-метр) любого типа, в комплекте с комбинированным стеклянным электродом и пределом абсолютной погрешности измерения ±0,1 ед. рН.
5.8 Пипетки градуированные различной вместимости по ГОСТ 29227.
5.9 Мерные колбы, пробирки и цилиндры различной вместимости по ГОСТ 1770.
5.10 Мешалка магнитная.
5.11 Стаканы исполнения 1 и колбы конические Кн различной вместимости по ГОСТ 25336.
5.12 Мельница лабораторная или гомогенизатор любого типа, для измельчения проб.
5.13 Шприцы однократного применения по ГОСТ ISO 7886-1.
5.14 Виалы стеклянные из темного стекла с крышкой и септой из полимерного материала подходящей вместимости.
Допускается применение других средств измерений с метрологическими характеристиками, вспомогательного оборудования и посуды с техническими характеристиками не ниже вышеуказанных.
6 Проведение определений
6.1 Общие положения
При проведении определений необходимо обеспечивать предельно короткий промежуток времени между приготовлением растворов проб и градуировочных растворов и их определением. Температура в помещении при проведении определений не должна превышать 25°С.
Максимальный срок использования градуировочных растворов — 8 ч с момента их приготовления.
6.2 Подготовка пробы
Пробу гомогенизируют. Если проба представляет собой продукт твердой консистенции, ее измельчают на мельнице подходящей конструкции и снова тщательно перемешивают. Определение проводят сразу после гомогенизации. Подготовку проб свежих фруктов и овощей проводят одновременно с экстракцией (см. 6.3.1).
6.3 Приготовление раствора пробы
Навеску пробы подходящей массы, например, 3 г (при содержании витамина C в пробе около 50 мг/100 г), взвешенной с точностью до 1 мг, помещают в мерную колбу вместимостью 100 см . Добавляют 80 см раствора метафосфорной кислоты, приготовленной по 4.2.8, содержимое колбы тщательно перемешивают, после чего объем в колбе доводят до метки. Содержимое колбы снова перемешивают, после чего фильтруют. Полученный раствор представляет собой экстракт из пробы.
Для свежих фруктов и овощей навеску предварительно измельченной ножом пробы массой от 2 до 10 г, взвешенной с точностью до 1 мг, помещают в стакан вместимостью 100 см , затем вносят некоторое количество раствора метафосфорной кислоты, приготовленной по 4.2.8. Содержимое стакана гомогенизируют, количественно переносят в мерную колбу вместимостью 100 см , перемешивают и фильтруют. Полученный раствор представляет собой экстракт из пробы.
Примечание — Стабильность аскорбиновой кислоты в растворе можно повысить, например, путем добавления к раствору метафосфорной кислоты 125 см раствора L-цистеина, приготовленного по 4.2.10, дитиотреитола (DTTA) или диэтилентриаминфосфорной кислоты (DTPA). При этом следует иметь в виду, что эти стабилизаторы могут влиять на качество хроматографического разделения. Данная процедура не использовалась при проведении межлабораторных испытаний.
6.3.2 Проведение реакции восстановления
20 см отфильтрованного экстракта (см. 6.3.1) переносят в стакан вместимостью 50 см , добавляют 10 см раствора L(+)-цистеина. Устанавливают значение рН полученного раствора в пределах 7,0-7,2 ед. рН (по рН-метру) путем добавления по каплям раствора трехзамещенного натрия фосфата, приготовленного по 4.2.9, при постоянном перемешивании на магнитной мешалке. По достижении указанного значения рН раствор выдерживают точно 5 мин при постоянном перемешивании. По истечении указанного времени устанавливают значение рН раствора в пределах 2,5-2,8 ед. рН (по рН-метру) путем добавления по каплям раствора метафосфорной кислоты, приготовленной по 4.2.7, при постоянном перемешивании на магнитной мешалке. Полученный раствор количественно переносят в мерную колбу вместимостью 50 см , при этом электроды рН-метра, рабочий элемент магнитной мешалки и стакан, в котором находился раствор, ополаскивают водой, перенося смывы в ту же колбу. Объем содержимого в мерной колбе доводят до метки водой, содержимое колбы перемешивают. Полученный раствор фильтруют через мембранный фильтр (см. 5.5), фильтрат используют для хроматографического определения.
Если в продукте имеется информация о наличии загустителей, рекомендуется провести их осаждение перед хроматографическим определением во избежание порчи хроматографической колонки. Для этого к порции восстановленного раствора пробы объемом 4 см добавляют 1 см метанола (см. 4.2.6). Полученный раствор перемешивают и фильтруют через мембранный фильтр (см. 5.5). Фильтрат используют для хроматографического определения.
Идентифицируют пик L-аскорбиновой кислоты путем сравнения времени удерживания на хроматограмме раствора пробы и на хроматограмме градуировочного раствора. Идентификацию пика L-аскорбиновой кислоты можно также проводить путем добавления стандартного раствора в раствор пробы.
Ниже приведены условия хроматографического определения, обеспечивающие требуемую степень хроматографического разделения и пригодные для количественного определения (см. также рисунок A.1. Данные условия были использованы при проведении межлабораторных испытаний):
колонка* заполненная сорбентом на основе силикагеля с привитыми группами C с размером частиц 5 мкм, длиной 250 мм, внутренним диаметром 4,0 мм;
Источник