Микробиологические методы получения витаминов

X Международная студенческая научная конференция Студенческий научный форум — 2018

ПОЛУЧЕНИЕ ВИТАМИННЫХ ПРЕПАРАТОВ

До 30-х годов прошлого столетия рибофлавин (витамин В2) выделяли из природного сырья. В наибольшей концентрации он присутствует в моркови и печени трески. Из 1 т моркови можно изолировать лишь 1 г рибофлавина, а из 1 т печени — 6 г. В 1935 г. обнаружен активный продуцент рибофлавина — гриб эремотециум эшби, способный при выращивании на 1 т питательной смеси синтезировать 25 кг витамина В2. Сверхсинтеза рибофлавина добиваются действием на дикие штаммы мутагенов, нарушающих механизм ретроингибирования синтеза витамина В2, флавиновыми нуклеотидами, а также изменением состава культуральной среды. Отбор мутантов ведут по устойчивости к аналогу витамина В2 — розеофлавину. [1]

Витамин В12 открыт в 1948 г. одновременно в США и Англии. В 1972 г. в Гарвардском университете был осуществлен химический синтез корриноидного предшественника витамина В12. Химический синтез корнестерона — структурного элемента корринового кольца витамина, включающий 37 стадий, в крупных масштабах не воспроизведен из-за сложности процесса.

Первоначально витамин В12 получали исключительно из природного сырья, но из 1 т печени можно было выделить всего лишь 15 мг витамина. Единственный способ его получения в настоящее время — микробиологический синтез. Продуцентами витамина В12 при его промышленном получении служат актиномицеты, метанообразующие и фотосинтезирующие бактерии, одноклеточные водоросли. Для получения высокоочищенных препаратов витамина В12 пропионовокислые бактерии культивируют периодическим способом на средах, содержащих глюкозу, казеиновый гидролизат, витамины, неорганические соли, хлорид кобальта. [4]

Из культуральной жидкости витамин В12 выделяют экстракцией органическими растворителями, ионообменной хроматографией с последующим осаждением из фракций в виде труднорастворимых соединений. В процессе получения витамина В12 с помощью пропионовокислых бактерий применяют дорогостоящую антикоррозийную аппаратуру, сложные и дорогие питательные среды. В последние годы исследуется возможность получения витамина с использованием иммобилизованных клеток пропионовокислых бактерий.[4]

Важное место в обмене веществ у животных занимает р-каротин, который в печени превращается в витамин А (ретинол). В организме человека и животных каротины не образуются. Основные источники р-каротина для животных — растительные корма; человек получает р-каротин также из продуктов животного происхождения. Р-Каротин можно выделить из ряда растительных объектов — моркови, тыквы, облепихи, люцерны. Установлено, что многие микроорганизмы — фототрофные бактерии, актиномицеты, плесневые грибы, дрожжи — синтезируют каротин. [6]

Микробиологическим способом получают и витамин D2 (эрго-кальциферол), при производстве которого освоено дешевое сырье (углеводороды) и установлен стимулирующий эффект ультрафиолетовых лучей на синтез эргостерина культурой дрожжей.

В основном в условиях промышленного производства пантотеновую кислоту получают методом химического синтеза. Наиболее важной коферментной формой витамина В5 является кофермент ацетилирования (КоА). Способностью продуцировать в значительных количествах КоА обладают многие микроорганизмы, в частности актиномицеты. Активно внедряются в промышленное производство способы получения пантотеновой кислоты и ее структурных компонентов из р-аланина и пантотеата калия с помощью иммобилизованных клеток бактерий, а также достигнуты существенные успехи при получении КоА с использованием мутантных штаммов Brevibacterium ammoniagenes, которые позволяют получать КоА в количестве до 3 г на литр. [8]

Одним из наиболее распространенных биотехнологических способов получения коферментной формы никотиновой кислоты — никотинамидадениндинуклеотида (НАД) является выделение (экстракция) его из микроорганизмов, как правило, из пекарских дрожжей. Для повышения содержания НАД в дрожжевых клетках культивирование проводят на средах с предшественниками синтеза никотиновой кислоты. Так, при добавлении в среды культивирования аденина или самой никотиновой кислоты получают до 12 мг НАД на 1 г клеток (по сухой массе).

Аскорбиновая кислота в мировом промышленном производстве витаминной продукции в целом занимает наибольшую долю — около 40 тыс. т в год. Ее синтез был разработан швейцарскими учеными А. Грюсснером и С. Рейхштейном в 1934 г. и используется до настоящего времени. Синтез аскорбиновой кислоты является многостадийным химическим процессом, в котором только одна стадия представлена биотрансформацией. Эта стадия трансформации d-сорбита в L-сорбозу при участии ацетатных бактерий. Для получения сорбозы используют глубинную ферментацию, когда культуру продуцента Gluconobacter oxydans выращивают в ферментерах периодического режима с мешалкой и барботером для усиления аэрации и массообмена в течение 20 — 40 ч с результатом по выходу сорбозы до 98% исходного количества сорбита в среде. Обычно для достижения такого высокого выхода целевого продукта в питательную среду вносят кукурузный или дрожжевой экстракт в количестве около 20%. По окончании ферментации сорбозу выделяют из культуральной жидкости. Помимо оптимизации среды можно совершенствовать и технологическую аппаратуру. Например, переход от периодического культивирования продуцента Gluconobacter oxydans к непрерывному, в аппарате колоночного типа увеличивает скорость образования сорбозы в 1,7 раз. [3]

Впервые кальциферол был выделен из рыбьего жира в 1936 г. А. Виндаусом и применен при лечении рахита. Он получил название витамина D3, так как ранее из растительных масел был выделен эргостерин под названием витамин D, при облучении которого получили витамин D2 — эргокальциферол (кальциферол — в переводе «несущий кальций»).

В настоящее время кальциферол производят из эргостерина с применением УФ-облучения биотехнологическим методом. В процессе преобразования эргостерина в эргокальциферол принимают участие микроорганизмы. Особенно богаты эргостерином клетки дрожжей всех видов и плесневые грибы. В сухой биомассе дрожжей содержится 5—10% эргостерина.

При дальнейшем УФ-облучении эргостерина получают витамин D2, который либо используется как пищевая добавка, либо подвергается дальнейшей обработке с целью получения кристаллического витамина D2. [5]

Витамин А — циклический, непредельный одноатомный спирт, образуемый в слизистой кишечника и печени из провитаминов под воздействием фермента каротиноксидазы. Каротиноиды — широко распространенная группа природных пигментов, образуемых высшими растениями, водорослями и некоторыми микроорганизмами. У животных эти пигменты не образуются, а поступают с продуктами питания и служат источником витамина А. [10]

Убихиноны в последнее время вызывают интерес как перспективные лечебные препараты. С одной стороны, они синтезируются в организме животных и человека, делая необязательным их поступление с пищевыми продуктами, что отличает их от группы витаминов.

В производстве убихинонов применяются биотехнологические методы, в основе которых лежит экстракция из биологического материала. В промышленном производстве убихинонов, в качестве субстрата используются как растительные ткани, так и микроорганизмы с высоким содержанием убихинонов, например дрожжи и грибы.

В настоящее время используется биотехнология получения уби-хинона-9 и эргостерина из микробных липидов, являющихся побочным продуктом крупного производства белково-витаминного концентрата при выращивании грибов Candida maltosa. [11]

Витамины необходимы для образования иммунных клеток и антител. Суточная потребность в витаминах может быть небольшой, но именно от обеспеченности витаминами зависит нормальная работа иммунной системы и энергетический обмен. Вот почему витаминный дефицит ускоряет старение организма и увеличивает частоту возникновения инфекционных заболеваний и злокачественных опухолей, что значительно сокращает продолжительность и качество жизни.

Специалисты рекомендуют принимать препараты, которые содержат в своем составе весь спектр жизненно важных витаминов, причем, что не менее важно, комплекс должен быть качественным и хорошо сбалансирован по дозировкам. Это будет гарантией эффективности и безопасности препарата. Высокое качество и оптимальные дозировки витаминов позволяют значительно снизить риск аллергических реакций, которые, к сожалению, нередко встречаются в последнее время.

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ

1. Карелин А.О. , Ерунова Н.В. «Витамины». — М.: серия советы доктора, 2002. — 160 с.2. Вент Ф. «В мире растений», -М.,1993 г. — 232 с3. Блинкин С.А. « Имунитет и здоровье», -М.: Знание. 1977г. — 316 с4. Вершигора А.Е. «Витамины круглый год»,-М 2007 г. — 159 с

6. Яннус А. Э. и Коллас С. Ю. Микробиология, эпидемиология и иммунобиология, 2010 г. — 426 с

7. Фердман Д. Л. В кн.: Витамины. Изд. АН УССР. Киев, 1986 г. — 285 с

8. Смирнова Л. А. Витаминные ресурсы. Витамин В12, его биосинтез, функции и применение. Изд. АН СССР. 1961 г. — 150 с

9. Минкина А. И. Биохимия, 2003 г. — 215 с

10. Игнатова Л. Н. Клиническая медицина, 2006 г. — 652 с

11. Березовский В. М. Химия витаминов. М., 1999 г. — 326 с

Источник

Тема 18. ТЕХНОЛОГИЯ ПРОИЗВОДСТВА ВИТАМИНОВ

Среди биологически активных веществ, необходимых для нормального развития организма животных, одно из первых мест занимают витамины. Важное значение витаминов объясняется их участием в биохимических реакциях, способностью служить катализаторами процессов, обеспечивающих обмен веществ в организме и его связь с окружающей средой.

Витамины — низкомолекулярные органические соединения, присутствующие в живых клетках в низких концентрациях и являющиеся компонентами энзиматических систем, ответственных за различные реакции.

Производство витаминов осуществляется следующими основными путями:

1. Экстракция витаминных препаратов из растительного или животного сырья. С этого направления начиналась витаминная промышленность, поскольку первые витаминные препараты были получены именно таким путем. Например, витамин В₁₂ получали из сырой печени крупного рогатого скота, каротин — из моркови. Но в настоящее время доля витаминов, получаемых этим методом, незначительна ввиду очень низкого содержания их в природном сырье и ограниченности сырьевых ресурсов.

2. Химический синтез витаминов. Производство синтетических витаминов занимает, пожалуй, ведущее место в современной витаминной промышленности, поскольку основная номенклатура витаминных препаратов представлена веществами, полученными химическим синтезом из химических видов сырья или сочетанием химического синтеза с биосинтезом. Однако такой способ производства витаминов представляет собой сложный, многоступенчатый процесс, сопряженный с большими производственными затратами, что делает конечные продукты слишком дорогими.

3.Биосинтез витаминов. Некоторые витамины, имеющие сложное строение, химический синтез которых в крупномасштабном производстве невозможен или экономически нецелесообразен, получают исключительно биосинтезом, с применением микроорганизмов, способных к сверхсинтезу и накоплению определенных витаминов. Примером может служить производство цианкобаламина (витамина В₁₂). Микробиологический синтез применяется также в производстве витаминных концентратов, предназначенных для сельского хозяйства, поскольку в данном случае обычно в индивидуальном чистом виде витамины не выделяют.

Следует отметить условность такого деления витаминной промышленности. Производство некоторых витаминов включает и химические стадии и стадии биотрансформации с применением микроорганизмов (например, производство аскорбиновой кислоты). Витамин рибофлавин получают и синтетическим и микробиологическим путями. Некоторые витаминные препараты (например, витамин D₂) получают путем химической модификации провитаминов или витаминов, выделенных из растительных клеток или органов животных.

Использование витаминов в качестве добавок в корма животных требует крупномасштабного производства, поэтому возникла необходимость в более дешевых способах изготовления витаминов. Таким перспективным способом получения ряда витаминов оказался микробиологический синтез.

Для нормальной деятельности организма животных и птиц необходимо включать в рационы витамины A, D, К, группы В и др.

Микробиологическая промышленность нашей страны выпускает кормовые препараты витаминов В₂ и B₁₂. Кроме того, микробиологическим можно считать и производство витамина D₂, который образуется из эргостерина при облучении ультрафиолетовым светом кормовых дрожжей.

Микроорганизмы содержат много различных витаминов, которые чаще всего являются компонентами ферментов. Состав и количество витаминов в биомассе зависят от биологических свойств культуры микроорганизмов и условий их культивирования. Так, кормовые дрожжи, получаемые на гидролизатах древесины и углеводородах, сравнительно богаты витаминами группы В и содержат (в расчете сухую биомассу) следующие витамины (мг/кг):

Рибофлавин (В₂) — 45-68

Инозит — 400 -5000

Фолиевая кислота — 3,4-21,5

Никотиновая кислота — 440-610

Продукцию микроорганизмами отдельных витаминов можно увеличить, изменяя состав питательной среды. Например, количество витамина В₂ (рибофлавина) в биомассе дрожжей зависит от интенсивности аэрации и содержания железа в среде.

На содержание витаминов в клетках дрожжей заметное влияние оказывают микроэлементы. Так, небольшие добавки марганца способствуют накоплению в клетках дрожжей инозита, а повышенные дозы кобальта приводят к увеличению содержания витамина В₆ (пиридоксина).

Производство кормового концентрата витамина В₂ (рибофлавин).Витамин В₂ входит в структуру многих ферментов, в составе которых участвует в клеточном дыхании, синтезе белков и жиров, регулировании состояния нервной системы, функции печени и т.д. При его недостатке резко замедляется рост, нарушается белковый обмен.

Суточная потребность в витамине В₂ составляет для птиц 3 — 4 г (кристаллического препарата) на 2 т корма, а для свиней 10 — 15 мг на 100 кг живой массы.

В природных условиях источниками рибофлавина являются высшие растения, дрожжи, мицелиальные грибы и бактерии. Большинство микроорганизмов образуют свободный рибофлавин.

В 30-е годы XX в. был найден суперпродуцент витамина — микроскопический гриб Eremothecium ashbyii, образующий до 6000 мкг рибофлавина на 1 г сухого вещества культуральной жидкости.

Для получения витамина В₂ можно также использовать культуру дрожжей, ацетобутиловые бактерии, продуцент лизина Brevibakterium и др.

Микроорганизмы — продуценты рибофлавина

Технология получения кормового препарата витамина В₂ микробиологическим способом достаточно проста. В качестве микроорганизма-продуцента обычно используют Е. ashbyii.

Технологический процесс производства состоит из трех основных стадий:

1. Аэробная ферментация.

2. Термолиз и концентрирование.

3. Сушка, размол, гранулирование и упаковка.

Посевной материал и стерильный воздух получают по типовой, для многих микробиологических производств, схеме. Ферментация осуществляется в типовых биореакторах объемом 63 — 100 м₃ в стерильных условиях при температуре 28 — 30 °С.

Основными ингредиентами питательной среды являются соевая мука, меласса, технический жир и минеральные соли (СаСОз, КН₂Р0₄). Продуцент витамина В₂ выращивают также на средах, где источником углерода является глюкоза, сахароза, крахмал, пшеничная мука. В качестве источника азота используют молочную сыворотку, рыбную и кукурузную муку или экстракт, казеин. Развитие гриба-продуцента стимулируется добавлением ненасыщенных жирных кислот, биотина, тиамина, инозита, ростовых веществ, содержащихся в зародыше пшеницы, картофельном соке и дрожжевом автолизате.

Известно использование в производственных условиях питательной среды следующего состава:

— 1 — 3 % мелассы, гидрола или глюкозы;

— 3 — 8 % кукурузного экстракта или дрожжевого автолизата;

— добавки N, Mg, Zn.

Культивирование продуцента проводят поверхностным или глубинным способом. Витамин накапливается в клетках гриба-продуцента, либо в виде предшественника — флавина дениннуклеотида, либо в свободном состоянии.

Время культивирования длится 60 — 80 ч до начала лизиса мицелия гриба и образования спор (определяется микроскопически). При этом содержание рибофлавина в культуральной жидкости достигает 1200 мг/л.

Для сохранения штамма Е. ashbyii в активном состоянии рекомендуется производить систематический его рассев на твердые питательные среды и отбирать колонии наиболее .интенсивно окрашенные в оранжевый цвет. Яркая окраска колонии коррелирует с высокой способностью к синтезу рибофлавина.

При подготовке инокулята гриб пересевают последовательно по схеме:

посев на скошенную агаризованную среду в пробирке > жидкая среда > колба > бутыль > инокулятор

Винокуляторе культуру выращивают в течение 21-26 ч. затем ее переводят а биореактор с питательной средой, содержащей кукурузную и соевую муку, кукурузный экстракт, свекловичный сахар, КН₂РО₄, СаСОз, NaCl и технический жир.

Среду стерилизуют в смесителе при 120 – 122 °С в течение 1 часа. Культивирование в биореакторе ведут до начала лизиса клеток и появления спор (определяют микроскопически). Температура культивирования 28 — 30 °С, давление воздуха в биореакторе (1 — 2) — 10 4 Па, расход воздуха 1,5 -2,0 л в минуту на 1 л культуральной жидкости. Выход рибофлавина около 1200 мг/л.

По окончании процесса ферментации культуральную жидкость вместе с мицелием передают в вакуум-выпарные аппараты (10), где ее нагревают до 80 °С с целью разрушения (термолиза) клеточных структур и одновременно ведут процесс концентрирования (упаривания) до содержания сухих веществ 30-40 %.

Полученный после упаривания концентрат в виде сиропообразной биомассы высушивают в распылительной сушилке до содержания влаги не более 8 %. В результате получают смесь биомассы мицелия Е. Ashbyii и сухих остатков питательной среды. Для получения однородного товарного продукта смесь размалывают и просеивают. На современных предприятиях концентрат гранулируют, поскольку порошкообразный продукт сильно пылит, что создает неудобства работы с ним и приводит к его потерям.

Кормовой концентрат витамина В₂ представляет собой обработанную, высушенную, размолотую или гранулированную биомассу гриба-продуцента Е. ashbyii, содержащую не менее 15 мг рибофлавин на 1 г вещества. Помимо витамина В₂, концентрат содержит 0,3- 0,5 % других витаминов группы В (В₁, В₆, В₁₂, никотинамид), около 20% белковых веществ, а также полисахариды, липиды, минеральные соли.

Для животноводства можно получить кормовой рибофлавин как отход при производстве ацетона. Продуцентами витамина при этом являются ацетобутиловые бактерии.

Преимущество и рентабельность микробного синтеза витамина В₂ иллюстрируется следующими цифрами: из 1 т моркови получают 1г витамина, из 1 т тресковой печени — 6 г, а из 1 т культуральной жидкости гриба E.ashbyii — 25 кг.

Производство витамина В₁₂(цианкобаламина).Среди неполимерных биологически активных соединений витамин В₁₂ имеет самое сложное строение. Его принятое химическое название α-(5.6-диметилбензимидазолил)-кобамидцианид. Это единственный витамин, в структуру которого входит кобальт.

Организм животных не способен к самостоятельному синтезу витамина В₁₂. Этот витамин полностью отсутствует в растительных кормах в относительно небольших количествах содержится в кормах животного происхождения (рыбной и мясо-костной муке, молочных отходах). Среди растительного мира витамин В₁₂ был обнаружен лишь у нескольких видов высших растений (горох, фасоль, побеги бамбука), причем его происхождение в этих растениях окончательно не установлено.

Цианокобаламин обладает высокой биологической активностью с широким спектром действия. В первую очередь, витамин B₁₂ необходим для нормального кроветворения и созревания эритроцитов, он является эффективным противоанемическим препаратом. Цианкобаламин применяют для лечения злокачественного малокровия, железодефицитных анемий, апластических анемий и т.п. Этот препарат назначают также при лучевой болезни, заболеваниях печени, полиневритах, болезни Дауна, детском церебральном параличе и многих других заболеваниях.

Для медицинских целей субстанцию витамина B₁₂ получают в виде кристаллического тёмно-красного порошка, содержащего не менее 99% основного вещества. Из этой субстанции готовят различные лекарственные формы, из которых наиболее широкое применение находят цианкобаламин в изотоническом растворе хлорида натрия для инъекций, и таблетки, содержащие цианкобаламин и фолиевую кислоту.

Важное значение витамин B₁₂ имеет для животноводства. Его недостаток тормозит рост животных и приводит к серьезным заболеваниям. Цианкобаламин повышает усвояемость белка растительных кормов и является необходимым фактором полноценного питания животных.

Для животноводства отечественной промышленностью выпускается кормовой концентрат витамина В₁₂ (КМВ-12), который по эффективности не уступает кристаллическому препарату, но является более дешевым и доступным для широкого использования в сельском хозяйстве.

Полный химический синтез витамина В₁₂ был осуществлен через 25 лет после его открытия Р. Вудвордом и А. Эшенмозером с участием большой группы исследователей нескольких лабораторий университетов и научных центров США, Англии, Франции, Японии. Конечно, химический синтез витамина В₁₂ имеет чисто теоретическое значение и в настоящее время он не может рассматриваться как вариант промышленного производства этого важного препарата.

Единственным способом получения витамина В₁₂ в промышленном масштабе является его микробиологический синтез с использованием специальных штаммов микроорганизмов, способных активно продуцировать этот витамин.

В природе витамин В₁₂ синтезируют многие микроорганизмы (например, метанобразующие и пропионовокислые бактерии), а также бактерии,осуществляющие термофильное метановое сбраживание сточных вод.

Активно продуцируют витамин В₁₂ представители рода Pzopionibacterium, природные штаммы которых образуют 1,0 — 8,5 мг/л цианокобаломина, а полученный искусственный мутант P. shermanii M-82 способен накапливать витамин В₁₂ до 58 мг/л.

Практический интерес для микробиологического синтеза этого витамина имеют представители актиномицетов и родственных микроорганизмов. Истинный витамин B₁₂ в значительных количествах синтезируют Nocardia rugoza (до 18 мг/л), а также представители рода Miromonospora. Высокой кобаламинсинтезирующей активностью обладают метаногенные бактерии, например, Methanosarcina barkeri, M. vacuolita и отдельные штаммы галофильного вида Methanococcus halophilus (до 16 мг/л).

Цианкобаламин синтезируют строго анаэробные бактерии из рода клостридий. В значительных количествах образуют витамин B₁₂ ацетогенные клостридии C.thermoaceticum, C.formicoaceticum и Acetobacter woodi, синтезирующие ацетат из СО₂.

Известны активные продуценты витамина Bi₂ переди псевдомонад. Некоторые штаммы Pseudomonas denitrificans нашли применение для промышленного получения цианкобаламина (фирма Merk, США). Интерес представляют также термофильные бациллы, а именно Bacillus eirculans и Bacillus stearothermophilus, которые растут при температурах, соответственно, 60 °С и 75 °С и за 18-24 культивирования без соблюдения стерильных условий дают высокие выходы витамина.

В нашей стране в качестве основного продуцента витамина В₁₂, получаемого для медицинских целей, используют культуру Propionibacterium shermanii, а для нужд животноводства применяют смешанную культуру, содержащую термофильные метанобразующие бактерии.

На большинстве зарубежных предприятий витамин В₁₂выпускают в чистом кристаллическом виде и применяют в животноводстве большей частью в виде компонентов премиксов.

Указанный способ включения витамина В₁₂ в кормовые рационы применяется и в нашей стране.

Источник