Метод определения витамина в12

Витамин В 12 и фолаты являются необходимыми компонентами при синтезе ДНК. Поэтому дефицит этих витаминов может вызывать нарушения в продукции, созревании и функциональном состоянии эритроцитов и лейкоцитов, вызывая мегалобластную анемию, с одной стороны, и изменения в нейропсихологических реакциях, с другой, причем последние могут проявляться независимо от наличия анемии. Витамин В12 синтезируется только микроорганизмами и поступает в организм человека и животных с мясной пищей. За всасывание витамина В12 ответственен внутренний “intrinsic” фактор в пищеварительном тракте. При его дефиците или отсутствии возникает пернициозная анемия. Источником фолатов являются овощи, фрукты и печень.

Структурно витамин В12 относится к кобаламинам, в состав которых входит корриновое кольцо, в центре которого находится атом кобальта, верхний лиганд, ковалентно связанный с кобальтом, и нуклеотидная боковая цепь. Фолиевая кислота относится к птероглютаминовым кислотам. Как витамин В12, так и фолаты имеют много дериватов. Среди известных витаминов кобаламины занимают первое место по структурной сложности и разнообразию, а по концентрации в организме — последнее. Однако, реакции, в которых они принимают участие, крайне важны для нормального метаболизма животных организмов. Это, прежде всего, реакция переноса метильных групп на гомоцистеин и участие в синтезе метионинсинтетазы, которая является одним из звеньев в каскаде реакций, ответственных за проведение нервных импульсов, а также реакция мутазного типа по превращению метилмеланила-КоА в сукцинил-КоА — ключевой стадии в метаболитических, и синтетических реакциях.

В связи с вышеуказанным, количественное определение витамина В12 и фолатов существенно как для гематологии, так и неврологии при проведения дифференциальной диагностики, назначении адекватной терапии и динамических наблюдений.

Поскольку содержание кобаламинов и фолатов в организме крайне незначительно, определение их возможно только современными высокочувствительными методами — радиоиммунными, энзимоиммунными и иммунофлюоресцентными. Большинство наборов, выпускаемых фирмами в данное время, приспособлено для автоматизированных “закрытых” систем и очень дороги, поэтому разработка относительно недорогого иммуноферментного метода, приспособленного для “открытой” системы, является весьма актуальной проблемой.

Мы решили применить твердофазный иммуноферментный метод, используя моноклональные антитела против витамина В12 и фолиевой кислоты производства фирмы Sigma.

Поскольку как витамин В12, так и фолаты являются гаптенами, для проведения иммуноэнзимного анализа требовалось получение конъюгатов этих соединений с бычьим сывороточным альбумином.

Получение конъюгатов проводили карбодиимидным методом. Для конъюгата витамина В12 использовали его карбоксильное производное, любезно предоставленное нам Рудаковой И.П., а для фолатов — фолиевую кислоту. Ниже мы приводим описание метода по получению конъюгатой Альб-В12 и Альб-фолат.

10 мг фолиевой кислоты (17,6мкмоль) и 10 мг карбоксилатного производного цианкобаламина (7 мкмоль) растворяли каждый в 2 мл абсолютного диметилформамида, и добавляли по 2 мг дициклогексилкарбодиимида(10 мкмоль) и по 5 мг N-гидроксисукцинимида(43 мкмоль). Реакционную смесь инкубировали в темноте в течение 3-х суток в случае фолиевой кислоты и 2-х — витамина В12 до выпадения кристаллов дициклогексилмочевины. Затем супернатант, содержащий N-гидроксисукцинимидилфолат добавляли к 20 мл раствора БСА (2,5мг/мл), а супернатант с N-гидрокси-сукцинимидилкобаламином — к 6,5 мл раствора БСА(10 мг/мл) в 0,1 М карбонатном буфере, рН 9,2. Реакцию конъюгирования проводили в течение 6 часов при комнатной температуре в темноте, после чего конъюгат диализовали в темноте при 4 ° С против 0,01М трис-хлоридного буфера, рН 7,2, содержащего 0,15М хлорида натрия для удаления несвязавшихся продуктов реакции( соответственно фолиевой кислоты и цианкобаламина). Степень модификации БСА фолиевой кислотой определяли спектрофотометрически, используя молярный коэффициент экстинкций 29100 М -1 см -1 при длине волны 297 нм. Она составляла 3 остатка на моль белка. Степень модификации БСА цианкобаламином определяли также спектрофотометрически, используя коэффициент экстинкции 8700 М -1 см -1 при l =550 нм. В нашем случае она составила 0,3 моля на моль белка.

Твердофазным носителем служили иммунологические планшеты фирмы Nunk, которые были сенсибилизированы растворами конъюгатов. Стандартные растворы получали из конъюгатов Альб-В12 и Альб-фолат, определяя их концентрацию спектрофотометрически, как указано выше. В данных системах был применен непрямой конкурентный метод иммуноферментного анализа с использованием моноклональных антител против витамина В12 и фолиевой кислоты. Количество связавшихся антител определяли, используя конъюгат анти-IgG человека с пероксидазой хрена /анти-IgG-ПХ/, по его связыванию с твердой фазой. Субстратом реакции служил ТМВ.

Была проведена работа по подбору эквивалентных концентраций всех реагентов, участвующих в реакции.

Ниже мы приводим условия постановки реакции с указанием подобранных разведений для всех реагентов.

Сенсибилизацию планшетов проводили конъюгатами Альб-В12 и Альб-фолат в разведении 1:20 в фосфатном буфере с БСА /ФБС/ в течение первых 3-х часов при 37 0 С, а затем в течение ночи в холодильнике. Затем планшеты были отмыты несколько раз ФСБ. Антигены, т.е. стандартные растворы и испытуемые образцы, предварительно прогревали при 100 0 С в растворе 0,3N NaOH с KCN и с дитиотретолом/ДТТ/ для перевода всех дериватов кобаламинов и фолатов в циан-форму и предотвращения денатурации при кипячении. Использовали следующие концентрации стандартных растворов: 1300 пг/мл, 650 пг/мл, 300 пг/мл, 150 пг/мл и 75 пг/мл — для витамина В12 и 20нг/мл, 10нг/мл, 5нг/мл и 2,5нг/мл — для фолатов.

Стандартные растворы и испытуемые образцы — 0,1 мл — помещали в специальные пробирки и добавляли по 0,1 мл раствора NaOH(0,3 N) c KCN(1мг/мл) и ДТТ (50мкл ДТТ на 6 мл раствора щелочи). Пробирки закрывали крышечками из фольги и помещали на 10 мин в кипящую водяную баню. Затем все пробы охлаждали и вносили по 0,1 мл в сенсибилизированные планшеты. Реакцию проводили в течение 12-14 часов при 4-6 0 , после чего планшеты снова отмывали, а затем вносили соответственно по 0,1 мл антител против витамина В12 в разведении 1:1000 и 0,1 мл антител против фолиевой кислоты в разведении 1:500. Планшеты снова помещали в холодильник на 12-14 часов, после чего их в очередной раз отмывали ФСБ. Затем во все лунки планшета вносили по 0,1 мл анти-IgG-ПХ в разведении 1:10000 и помещали в термостат на 2 часа, снова отмывали ФСБ и затем добавляли по 0,1 мл ТМВ, а после развития окраски через 10-15 мин реакцию закрепляли 4% H 2 SO 4 . Результаты спектрофотометрировали на приборе Titertek Multiskan при l 450 nm. На основании стандартных разведений строили кривую, по которой затем определяли концентрации исследуемых соединений в испытуемых образцах.

Ниже приведены стандартные кривые, полученные при использовании разработанного нами метода. Для проверки набора мы использовали также фирменные стандартные разведения, любезно предоставленные нам Деминой Д.Г. Кривая с фирменными разведениями аналогична кривой с нашими реактивами (рис.1,2).

Проверка набора по контрольным сывороткам также дала положительные результаты: в сыворотке с содержанием витамина В12 900- 1000 пг/мл получено значение 1200 пг/мл, а в сыворотке с уровнем В12 200-250 пг/мл мы получили 180 пг/мл. Подобная сходимость была получена и в отношении определения фолатов: при 16-20нг/мл — 18,5нг/мл, а при 2-4нг/мл — 3,5нг/мл. Кроме того, в нескольких образцах сыворотки определение витамина В12 было проведено нами и в центральном диагностическом центре. Результаты были сходными: 1070 пг/мл — в диагностическом центре и 1200 пг/мл у нас, 250 пг/мл в диагностическом центре и 225 пг/мл с нашим набором.

Всего определение витамина В12 и фолиевой кислоты было проведено в образцах крови 25-ти доноров и 250-ти больных с различными видами анемий. Средние значения витамина В12 в норме составило 700 ± 150 пг/мл (350-900), среднее значение фолиевой кислоты — 7,5 ± 2,3 нг/мл(5,8-10), что соответствует литературным данным.

У больных с железодефицитной анемией /ЖДА/ до лечения уровень витамина В12 составлял 926 ± 205,5 пг/мл, а после проведения ферротерапии при нормализации уровня Нв снизился до 276 ± 49,9 пг/мл Уровень фолатов до терапии был 15,6 ± 5,3 нг/мл, а после терапии — 9,0 ± 2,2 нг/мл. Данные результаты вполне логичны, поскольку эти витамины потребляются при синтезе гемоглобина. У больных с лимфопролиферативными заболеваниями наблюдались повышенные значения витамина В12, в отдельных случаях даже до 2000 пг/мл и пониженное содержание фолатов — до 2,5 нг/мл. У больных с миелопролиферациями отмечено понижение как витамина В12, так и фолиевой кислоты. Полученные нами результаты согласуются с литературными данными.

Таким образом, разработанная нами система для определения витамина В12 и фолатов на основе “открытого” иммуноферментного метода может быть использована при диагностике и динамическом лечении различных форм анемий.

Источник

Витамин B12 (цианокобаламин)

Витамин В₁₂ – это водорастворимый витамин, который играет важную роль в нормальном функционировании нервной системы и формировании клеток крови. Его дефицит может вызвать серьезные изменения в организме.

Кобаламин, антианемический витамин.

Диапазон определения: 100 — 4000 пг/мл.

Пг/мл (пикограмм на миллилитр).

Какой биоматериал можно использовать для исследования?

Как правильно подготовиться к исследованию?

Не принимать пищу в течение 2-3 часов до исследования, можно пить чистую негазированную воду.
Исключить физическое и эмоциональное перенапряжение и не курить в течение 30 минут до исследования.

Общая информация об исследовании

Определение концентрации витамина В₁₂ в сыворотке крови – стандартный метод диагностики его дефицита.

Витамин В₁₂ содержится исключительно в продуктах животного происхождения, таких как мясо (особенно печень и почки), рыба, яйца, молочные продукты. В последние годы важным источником витамина В₁₂, особенно для вегетарианцев, стали обогащенные им каши, хлеб, сухие завтраки и другие зерновые продукты.

В₁₂ важен для синтеза нуклеиновых кислот, образования эритроцитов, клеточного и тканевого обмена, к тому же он участвует в поддержании нормального функционирования нервной системы. Дефицит витамина В₁₂ может привести к развитию макроцитарной (мегалобластной) анемии. Основным ее проявлением является уменьшение количества эритроцитов в крови, но увеличение при этом их размера – образование макроцитов. Макроциты, как правило, имеют более короткую продолжительность жизни по сравнению с нормальными эритроцитами и больше склонны к гемолизу, что приводит к усталости, слабости и другим симптомам анемии. Недостаток витамина В₁₂ грозит поражением нервной системы (фуникулярным миелозом), которое проявляется в виде покалывания в ногах и руках пациента (дистальные парестезии), расстройстве чувствительности, повышении сухожильных рефлексов.

Основные причины дефицита витамина В₁₂ в организме

Недостаточное поступление. В₁₂ накапливается преимущественно в печени и селезенке. Так как запасы этого витамина в организме достаточно велики, а выведение происходит медленно, для создания значимого дефицита требуется около 5 лет недостаточного поступления его в организм. Соответственно, группами риска являются голодающие люди и вегетарианцы.

Нарушение всасывания. Дефицит В₁₂ иногда возникает при различных заболеваниях тонкой кишки, нарушающих всасывание этого витамина (целиакии, болезни Крона, снижении кислотности желудочного сока (ахлоргидрии), а также при уменьшении реабсорбирующей поверхности после резекции тощей кишки. Однако наиболее частая причина дефицита В₁₂ – пернициозная анемия. В основе этого заболевания лежит врождённая неспособность желудка секретировать вещество, необходимое для всасывания витамина В₁₂ в кишечнике.

Нарушение утилизации. Различные заболевания печени и почек, а также злоупотребление алкоголем приводит к снижению накопления и увеличению выделения витамина В₁₂.

Увеличение потребности организма в витамине. При различных заболеваниях, требующих большого количества витамина В₁₂, например гемолитической анемии, гипертиреозе и альфа-талассемии.

Читайте также: Omega витамины для кошек

Для чего используется исследование?

В первую очередь, для выявления причин макроцитарной анемии.
Чтобы оценить состояние здоровья и сбалансированность питания пациентов с признаками недоедания и мальабсорбции, людей, страдающих алкоголизмом или различными формами нарушения всасывания (целиакией, болезнью Крона).
Пожилым людям тест на В₁₂ может помочь определить причину изменений в психике и поведении.
Пациентам, страдающим дефицитом витамина В₁₂, регулярное определение его концентрации позволяет контролировать процесс лечения. Особенно это актуально для людей с врождёнными дефектами всасывания витамина В₁₂, вынужденных принимать препараты всю жизнь.

Когда назначается исследование?

Если при общем анализе крови, проведенном рутинно или как часть диагностики симптомов анемии, обнаруживают эритроциты увеличенных размеров.
При выявлении причин изменений в поведении: появлении раздражительности, спутанности сознания, депрессии и/или паранойи (особенно у пожилых людей).
При неспецифических симптомах, указывающих на дефицит витамина В₁₂, таких как головокружение, слабость, усталость, изменения со стороны ЖКТ (глоссит, увеличение печени).
При необходимости проверки на дефицит B₁₂ пациентов с различными неврологическими нарушениями: парестезией и онемением рук и/или ног, нарушением чувствительности, периферической невропатией.
При исследовании здоровья пациентов с подозрением на недостаточное питание или на нарушение всасывания витамина В₁₂, при различных заболеваниях кишечника.
Когда дефицит В₁₂ обнаружен у ребенка, находящегося на грудном вскармливании, необходимо обследовать его мать на нехватку этого витамина.
Периодический контроль уровня В₁₂ позволяет оценить эффективность лечения авитаминоза.

Что означают результаты?

Референсные значения: 197 — 771 пг/мл.

Снижение концентрации витамина B₁₂ с большой вероятностью указывает на его дефицит, но не обязательно отражает уровень тяжести анемии или нейропатии.

Повышение уровня витамина В₁₂ обычно клинически не контролируется. Оно может происходить при лейкемии или нарушении функции печени.

Причины снижения уровня витамина В₁₂

Пернициозная анемия – заболевание, обусловленное нарушением кроветворения из-за недостатка в организме витамина B₁₂. В его основе лежит врождённая неспособность желудка секретировать внутренний фактор – вырабатываемое добавочными клетками желудка комплексное соединение, необходимое для усвоения витамина В₁₂ в кишечнике.
Потеря витамина при глистных инвазиях (широком лентеце).
Беременность (чаще в последнем триместре).
Полная или частичная гастроэктомия.
Атрофический гастрит.
Воспалительные заболевания кишечника (болезнь Крона, неспецифический язвенный колит, регионарный энтерит).
Болезни кишечника, сопровождающиеся нарушением всасывания (целиакия, спру).
Врождённое отсутствие транскобаламина-2, из-за которого нарушается всасывание и транспортировка витамина В₁₂.
Туберкулез подвздошной кишки.
Лимфома тонкой кишки.

Причины повышения уровня витамина В₁₂

Острая и хроническая миелогенная лейкемия.
Болезни печени (острый и хронический гепатит, цирроз, печеночная кома). Нарушение депонирования витамина В₁₂ в печени.
Истинная полицитемия – злокачественное заболевание кроветворной системы, сопровождающееся гиперплазией клеточных элементов костного мозга и увеличением уровня сывороточного витамина В₁₂.

Что может влиять на результат?

Уровень витамина В₁₂ понижается при его недостатке в пище (вегетарианстве) и злоупотреблении алкоголем.
Оральные контрацептивы, колхицин, противосудорожные препараты, антибиотики понижают концентрацию В₁₂.
Если при одновременном дефиците витамина В₁₂ и фолиевой кислоты пациент получает только препараты фолиевой кислоты, уровень витамина В₁₂ может быть нормальным или повышенным.

При подозрении на дефицит В₁₂ необходимо провести тест на фолиевую кислоту, так как зачастую их уровни взаимосвязаны.
Уровень витамина В₁₂ может повышаться при неправильном лечении препаратами витамина В₁₂.

Кто назначает исследование?

Гематолог, терапевт, невролог, диетолог, гастроэнтеролог, онколог.

Источник