Лабораторная работа № 4 Количественное определение витамина с (аскорбиновой кислоты) в пищевых продуктах и в моче по методу Тильманса
В настоящее время существуют методы определения витамина С и его производных в крови, тканях, слюне, пищевых продуктах и фармакопейных препаратах.
Может быть использовано спектрофотометрическое определение, использование капиллярного электрофореза, поточно-флюоресцентного метода и определение с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии.
Одним из наиболее широко распространенных методов количественного определения витамина С является оксидометрический метод, основанный на способности аскорбиновой кислоты (АК) восстанавливать 2,6-дихлорфенол, который при этом переходит в бесцветную лейкоформу. Этот метод определяет только восстановленную форму АК. С его помощью можно получить сведения о содержании витамина С в пищевых продуктах, а также в к сыворотке крови и других биологических тканях, и на основе полученных данных судить об обеспеченности им организма .
В гигиенических исследованиях использование данного метода позволяет контролировать сохранность витамина С в пищевых продуктах в зависимости от способов и сроков хранения, характера технологической и, в частности, кулинарной обработки пищи, позволяет выявить изменения в обмене витамина С при воздействии химических веществ на организм в производственных условиях .
Исследуемый материал: 1. Хвоя; 2. Картофель сырой и варёный; 3. Капуста квашеная и свежая; 4. Моча.
Реактивы и оборудование: 1. Натриевая соль 2,6-дихлорфенолиндофенол 0,001 Н раствор; 2. Хлороводород 10% раствор; 3. Весы и разновесы; 4. Мер-ные цилиндры на 50 и 10 мл; 5. Пипетки на 1 мл; 6. Фарфоровые ступки с
пестиками; 7. Микробюретки; 8. Стеклянные палочки; 9. Колбочка или широкие пробирки; 10. Бюретки; 11. Скальпель; 12. Воронки; 13. Вата.
Принцип метода: определение витамина С основано на его сильной редуцирующей способности.
При определении используют окислительно-восстановительную реак-цию между аскорбиновой кислотой и 2,6-дихлорфенолиндофенолом (2,6-ДХФИФ) — краской Тильманса в кислой среде. Раствор 2,6-ДХФИФ в нейт-ральной среде окрашен в синий цвет. Пока в растворе есть аскорбиновая кис-лота, названный реактив восстанавливается ею и при этом обесцвечивается. После окисления им всей аскорбиновой кислоты избыток реактива окраши-вает раствор в кислой среде в слабо розовый цвет. При появлении окраски титрование прекращают и замечают количество раствора 2,6-ДХФИФ, затра-ченного на титрование.
Витамин С (восстанов- 2,6 -ДХФИФ
ленная форма) (окисленная форма)
Витамин С (окисленная форма) 2,6-ДХФИФ (восстановленная форма)
Определение содержания витамина «с» в хвое и свежей капусте.
Хвоя и капуста содержат большое количество витамина С, поэтому для его определения нужно брать лишь небольшую часть исследуемого материала.
Приготовление вытяжки: Хвою или свежую капусту отвешивают на весах в количестве 1,0 г и тщательно измельчают в фарфоровой ступке с 2 мл 10% раствора хлорводорода. Растертую массу осторожно, без потерь (палочкой) переносят в мерный цилиндр (на 40 мл для хвои и на 10 мл для капусты, ступку и пестик обмывают 10% раствором соляной кислоты и промывную жидкость присоединяют к общей порции вытяжки. Объем жидкости в цилиндре доводят дистиллированной водой до метки 40 мл для хвои и до метки 10 мл для свежей капусты. Содержимое цилиндра перемешивают и оставляют стоять 10 мин. Не встряхивая, вытяжки филь-труют через ватный фильтр и 1 мл фильтрата употребляют для титрования.
Титрование: в колбочку отмеривают пипеткой 1 мл фильтрата и прибавляют к нему 19 мл воды. Содержимое титруют из микробюретки
0,001 Н раствором 2,б-ДХФИФ до появления слабо розового окрашивания, не исчезающего в течение 30 с. Вычисляют содержание витамина С в 100 г хвои или свежей капусты.
Расчет: молекулярная масса аскорбиновой кислоты равна 176. Находят грамм-эквивалент аскорбиновой кислоты. В реакции с 2,6-ДХФИФ она двухосновная, следовательно, грамм-эквивалент равен М/2=176/2=88 г, а 1 мл 0,001 Н раствора 2,6-ДХФИФ соответственно равен 0,088 г аскорбиновой кислоты. Количество миллилитров 2,6-ДХФИФ, затраченного на титрование исследуемого раствора, эквивалентно содержанию витамина С в титруемой жидкости. Расчет содержания витамина С (Х) в 100 г хвои или капусты проводится по следующей формуле:
Х==0,088 . а . с . 100/(b . d),
где а — объем раствора 2,6-ДХФИФ, пошедшего на титрование; d – взятая навеска хвои или свежей капусты; с — общий объем вытяжки; b — объем водной вытяжки, взятой для титрования (1 мл).
Источник
Ход работы
Задание 2. Количественное определение витамина с 2,6–дихлорфенолиндофенолом (по Тильмансу)
Метод количественного определения аскорбиновой кислоты основан на ее способности восстанавливать 2,6–дихлорфенолиндофенол, которым титруют исследуемый раствор в кислой среде, предохраняющей аскорбиновую кислоту от разрушения. Точному количественному определению аскорбиновой кислоты могут мешать другие легко окисляемые вещества, такие, как глютатион, цистеин и др.
Ход работы
1. Приготовьте вытяжку из хвои. Точную навеску хвои массой1 г тщательно разотрите в фарфоровой ступке со щепоткой битого стекла (песка) с 5 мл
2 % – го раствора соляной кислоты, затем без потерь (обмывая ступку и пестик тем же раствором соляной кислоты) перенесите содержимое ступки в мерную колбу емкостью 50 мл и доведите дистиллированной водой до метки. Содержимое колбы тщательно перемешайте, профильтруюете через бумажный фильтр, фильтрат используйте для определения витамина С.
2. Титрование. В 2 конические колбочки отмерьте пипеткой по 5 мл фильтрата, и протитруйте из бюретки0,001 Мрастаором 2,6–дихлорфенолиндофенола до появления розового окрашивания, не исчезающего около 30 с.
Расчет количества аскорбиновой кислоты в пробе проведите исходя из того, что 1 мл 0,001 М раствора 2,6 – дихлорфенолиндофенола соответствует 0,088 мг аскорбиновой кислоты. При расчете на 100 г вещества необходимо учитывать также разведение и количество исходного вещества.
Источник
Лабораторная работа №4 Витамины. количественное определение витамина С 2,6-дихлорфенолиндофенолом (по тильмансу)
Лабораторная работа №4
ВИТАМИНЫ. КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ ВИТАМИНА С
2,6-ДИХЛОРФЕНОЛИНДОФЕНОЛОМ (ПО ТИЛЬМАНСУ)
Недостаточность аскорбиновой кислоты в пище вызывает у человека заболевание, известное под названием скорбута, или цинги. Клинические симптомы недостаточности сначала проявляются быстрой утомляемостью, анемией, головокружением, затем появляется кровоточивость десен, склонность к кровоизлияниям в подкожную клетчатку, признаки нарушения сердечной деятельности, а также резкое снижение сопротивляемости организма инфекциям,
 |
Аскорбиновая кислота является лактоном ненасыщенной гексоновой кислоты. Наличие в ее молекуле двойной С2—С3 связи делает подвижными протоны гидроксильных групп у тех же атомов, что обусловливает кислый характер соединения с резко выраженной редуцирующей способностью. При окислении аскорбиновая кислота переходит в дегидроаскорбиновую кислоту:
В чистом виде аскорбиновая кислота представляет собой бесцветные кристаллы без запаха, кислого вкуса, хорошо растворимые в воде и спирте и нерастворимые в большинстве органических растворителей. В кристаллическом виде аскорбиновая кислота устойчива, но в присутствии окислителей легко разрушается в водных и особенно щелочных растворах, образуя щавелевую и треоновую кислоты.
 |
Работа 1. Количественное определение витамина С
2,6-дихлорфенолиндофенолом (по Тильмансу)
Метод количественного определения аскорбиновой кислоты основан на ее способности восстанавливать 2,6-дихлорфенолиндофенол, которым титруют исследуемый раствор в кислой среде, предохраняющей аскорбиновую кислоту от разрушения.
Оборудование и реактивы: весы, фарфоровая ступка, пестик, мерные колбы на 50 мл, воронка, фильтр, стеклянная палочка, конические колы, бюретка, 2% раствор соляной кислоты, дистиллированная вода, 0,001 н. раствор 2,6-дихлорфенолиндофенола
Материалы: различный растительный материал (хвоя, шиповник, капуста, клубни картофеля, яблоки и др.)
1. Приготовление фильтрата. Точную навеску растительного материала (сухих ягод шиповника – 1 г, хвои – 1 г, капусты – 5 г, картофеля – 5 г и т. д.) тщательно растирают в фарфоровой ступке с 4 мл 2% раствора соляной кислоты, добавив немного измельченного стекла. Затем без потерь переносят содержимое ступки в мерную колбу емкостью 50 мл, несколько раз смывая ступку водой и сливая ее по стеклянной палочке в ту же колбу, и доводят объем раствора дистиллированной водой до метки. Полученную смесь оставляют на 5-10 мин. Содержимое колбы тщательно перемешивают, фильтруют через бумажный фильтр и фильтрат используют для определения витамина С. Экстракт, полученный из картофеля, не фильтруют.
2. Титрование. Для титрования в конические колбочки отмеривают определенный объем фильтрата: шиповника — 1 мл, хвои – 5 мл, капусты – 5 мл. картофеля – всю полученную смесь без фильтрации. В каждую колбочку добавляют по 4 мл 2% раствора соляной кислоты и титруют из бюретки 0,001 н. 2,6-дихлорфенолиндофенолом до появления розового окрашивания, не исчезающего около 30 с.
Одновременно проводят контрольное титрование смеси реактивов. Число миллилитров раствора краски, пошедших на контрольное титрование, вычитают из числа миллилитров, пошедших на титрование вытяжки.
3. Обработка результатов. Результаты работы занесите в таблицу:
Источник
Пищевая химия: учебник для студентов вузов
Лабораторная работа 35. Титриметрические методы определения витамина С
Сущность титриметрического метода заключается в том, что 2, 6-дихлорфенолиндофенол выступает не только как окислитель, но и как индикатор, по которому определяют окончание титрования. Окраска раствора 2, 6-дихлорфенолиндофенола зависит от рН среды, а при восстановлении он переходит в лейкоформу.
Количественное определение ведут путем добавления к подкисленному раствору, содержащему витамин С, щелочного раствора краски Тильманса. Пока в титруемом растворе содержится витамин С, добавляемый раствор 2, 6-дихлорфенолиндофенола, имеющий глубокий синий цвет, обесцвечивается с образованием лейкоформы (индикатор), за счет присутствия восстановленной формы АК. Как только все количество АК в анализируемом растворе окислится до ДАК, раствор приобретает красную окраску, характерную для окисленной формы 2, 6-дихлорфенолиндофенола в кислой среде. Метод стандартизирован (ГОСТ 30627.2–98 – Методы измерений массовой доли витамина С (аскорбиновой кислоты).
Ход анализа . Точную навеску (около 5–10 г) предварительно измельченного исследуемого материала поместить в фарфоровую ступку. Небольшими порциями добавить 20 мл 1%-го раствора соляной кислоты, тщательно растирая пробу до получения однородной кашицы. Смесь количественно перенести в мерную колбу вместимостью 100 мл (общий объем соляной кислоты не должен превышать 50 мл). Ступку и пестик ополоснуть 1%-м раствором щавелевой кислоты и собрать смывы в ту же мерную колбу. Объем раствора довести до метки раствором щавелевой кислоты.
Содержимое колбы перемешать и через 5 минут отфильтровать через складчатый фильтр в сухую колбу или центрифугировать. Полученный фильтрат или фугат в количестве 1–10 мл (в зависимости от содержания витамина) отобрать пипеткой в коническую колбу и довести объем раствора дистиллированной водой до 15 мл. Анализируемый раствор оттитровать из микробюретки 0,001 н раствором 2, 6-дихлор-фенолиндофенола до появления розового окрашивания, не исчезающего в течение 30–60 с.
Контрольный опыт . Для оценки поправки на присутствие других редуцирующих веществ в используемых реагентах к 10 мл фильтрата или фугата прилить 0,1 мл 10%-го раствора сернокислой меди и выдержать при температуре 110 0 С в течение 10 минут для разложения АК. После охлаждения добавить 5 мл дистиллированной воды и оттитровать анализируемый раствор из микробюретки 0,001 н раствором 2, 6-дихлорфенолиндофенола. Для титруемого объема в 15 мл объем титранта, пошедшего на контрольный опыт, обычно составляет 0,04–0,06 мл. Эту поправку необходимо вычесть из объема титранта, пошедшего на титрование опытного образца. Рассчитать массовую долю аскорбиновой кислоты ( С АК , мг %) в анализируемом материале по формуле
C A K = T × V 1 × V 2 m × V 3 × 100 ,
где Т – титр 0,001 н раствора 2, 6-дихлорфенолиндофенола по аскорбиновой кислоте, 0,088 мг/мл;
V 1 – объем 0,001 н раствора 2, 6-дихлорфенолиндофенола, пошедшего на титрование экстракта с учетом поправки на реагенты, мл;
V 2 – общий объем экстракта, 100 мл;
V 3 – объем экстракта, взятого на титрование, 15 мл;
m – масса навески исследуемого материала, г;
100 – коэффициент пересчета на 100 г.
Определение витамина С в окрашенных растворах
Многие растительные материалы дают окрашенные экстракты, что затрудняет определение АК путем прямого титрования краской Тильманса. В этом случае титрование ведут в присутствии растворителей, которые сами нерастворимы в воде, но растворяют краску и не растворяют пигменты экстракта, таких как хлороформ или смесь толуола и изобутилового спирта (1:1).
Ход анализа . Точную навеску (около 5–10 г) растительного материала растереть в фарфоровой ступке в 20 мл 1%-ной соляной кислоты. Полученный гомогенат количественно перенести в мерную колбу вместимостью 100 мл и довести объем до метки 1%-ным раствором щавелевой кислоты. Соотношение соляной и щавелевой кислот должно составить 1:5. Содержимое колбы перемешать и через 5 минут отфильтровать через складчатый фильтр в сухую колбу.
В пробирку вместимостью 20 мл отмерить пипеткой 5 мл отфильтрованного окрашенного экстракта, добавить мерным цилиндром 5 мл хлороформа и оттитровать 0,001 н раствором 2, 6-дихлор-фенолиндофенола при осторожном перемешивании, наклоняя пробирку. Титрование прекратить при появлении красного окрашивания в слое хлороформа.
Для оценки поправки на реагенты приготовить контрольный раствор. В качестве контрольного раствора использовать 5 мл смеси из 1%-ных растворов соляной и щавелевой кислот (в соотношении объемов 1:5) и 5 мл хлороформа. Объем титранта, пошедший на контрольный опыт, необходимо вычесть из объема титранта, пошедшего на титрование опытного образца. Рассчитать массовую долю аскорбиновой кислоты ( С АК , мг %) по формуле
C A K = T × V 1 × V 2 m × V 3 × 100 ,
где Т – титр 0,001 н раствора 2, 6-дихлорфенолиндофенола по аскорбиновой кислоте, 0, 088 мг/мл;
V 1 – объем 0,001 н раствора 2, 6-дихлорфенолиндофенола, пошедшего на титрование экстракта с учетом поправки на контрольный опыт, мл;
V 2 – общий объем экстракта, 100 мл;
V 3 – объем экстракта, взятого на титрование, 5 мл;
m – масса навески исследуемого материала, г;
100 – коэффициент пересчета на 100 г.
Определение содержания витамина С в молочных продуктах
Содержание витамина С в сыром молоке зависит от времени года, индивидуальных особенностей животного и колеблется в интервале 0,3–2 мг%. В свежем молоке 67–68% приходится на восстановленную форму витамина С (АК) и 22–33% на окисленную (ДАК). Окисление витамина С в молоке катализирует аскорбатоксидаза и ускоряется в присутствии металлов (железа, меди), света, воздуха. Прямому определению АК в молоке препятствуют белки, способные связывать 2, 6-дихлорфенолиндофенол. В связи с этим определение АК ведут в безбелковом фильтрате. Белки осаждают с помощью насыщенного раствора хлорида натрия или раствора кислоты (метафосфорной, щавелевой, соляной).
Ход анализа . Навеску анализируемого молочного продукта (10 г) растворить 15–25 мл 6%-го раствора метафосфорной кислоты, количественно перенести в мерную колбу вместимостью 50 мл и довести объем смеси до метки тем же раствором кислоты (вместо метафосфорной кислоты можно использовать 2%-ный раствор соляной кислоты). Полученную смесь перемешать и отфильтровать. В коническую колбу для титрования отобрать пипеткой 1 мл фильтрата, довести объем до 15 мл дистиллированной водой и оттитровать из микробюретки 0,001 н раствором 2,6-дихлорфенолиндофенола до появления слаборозового окрашивания, не исчезающего в течение 30–60 с.
Рассчитать массовую долю аскорбиновой кислоты ( С АК , мг %) в анализируемом молоке по формуле
C A K = T × V 1 × V 2 m × V 3 × 100 ,
где Т – титр 0,001 н раствора 2, 6-дихлорфенолиндофенола по аскорбиновой кислоте, 0,088 мг/мл;
V 1 – объем 0,001 н раствора 2, 6-дихлорфенолиндофенола, пошедшего на титрование анализируемого образца с учетом поправки на реагенты, мл;
V 2 – общий объем раствора, 50 мл;
V 3 – объем раствора, взятого на титрование, 1 мл;
m – масса навески исследуемого материала, г;
100 – коэффициент пересчета в проценты.
Упрощенный йодатный метод определения витамина С в молоке
В основе йодатного метода лежит реакция окисления АК йодноватокислым калием до ДАК.
Определение витамина С упрощенным йодатным методом не применяют для анализа жидких концентратов из плодов шиповника, консервированных продуктов, свежеотжатых соков, свежих плодов, овощей, сушенных продуктов, витаминизированных чаев.
Ход анализа . Экстракцию витамина С провести с использованием 2%-го раствора соляной кислоты по методике, указанной выше. На анализ отобрать 1–5 мл экстракта (в зависимости от содержания витамина С) в коническую колбу вместимостью 100 мл, куда заранее добавить 0,5 мл 1%-го раствора йодистого калия, 1 мл 1%-го раствора крахмала и воды (3,5–7,5мл) с таким расчетом, чтобы общий объем смеси составил 10 мл. Полученный раствор оттитровать из микробюретки 0,001 н раствором йодноватокислого калия до появления устойчивого слабо синего окрашивания. Рассчитать содержание аскорбиновой кислоты ( С АК , мг %) в анализируемом молоке по формуле
C A K = T × V 1 × V 2 m × V 3 × 100 ,
где Т – титр 0,001 н раствора йодноватокислого калия по аскорбиновой кислоте, 0,088 мг/мл;
V 1 – объем 0,001 н раствора йодноватокислого калия, пошедшего на титрование анализируемого образца с учетом поправки на контрольный раствор, мл;
V 2 – общий объем экстракта, 1–5 мл;
V 3 – объем раствора, взятого на титрование, 10 мл;
m – масса навески исследуемого материала, г;
100 – коэффициент пересчета в проценты
Контрольный опыт . В коническую колбу отмерить 0,5 мл 1%-го раствора йодистого калия, 1 мл 1%-го раствора крахмала, 1 мл 2%-го раствора соляной кислоты и воды с таким расчетом, чтобы общий объем жидкости составил 10 мл, и оттитровать из микробюретки 0,001 н раствором йодноватокислого калия до появления устойчивого слабо синего окрашивания.
Необходимые реактивы, посуда, оборудование :
§ 1-, 2%-ные растворы соляной кислоты, 1%-ный раствор щавелевой кислоты, 6%-ный раствор метафосфорная кислота (Н n P n O 3n ), 10%-ный раствор сульфата меди, 2%-ный раствор серной кислоты, аскорбиновая кислота кристаллическая, 1%-ный раствор крахмала, 0,001 н раствор 2,6-дихлор-фенолиндофенола, аскорбиновая кислота кристаллическая, хлороформ, 1%-ный раствор йодистого калия, 0,001 н раствор йодноватокислого калия ( KJO 3 ), кристаллический йодид калия;
§ колбы для титрования, пипетки, микробюретки, фарфоровые ступки с пестиком, мерные колбы вместимостью 50 мл, 100 мл, делительные воронки, воронки для фильтрования, мерные цилиндры, пробирки;
§ аналитические весы, центрифуга, термостат на 110 0 С.
1%-ный раствор соляной кислоты . В мерную колбу вместимостью 1000 мл отмерить 23 мл соляной кислоты плотностью 1,185 г/мл, развести 300 мл дистиллированной воды и довести объем раствора до метки.
0,001 н раствор йодноватокислого калия ( KJO 3 ) . Навеску йодата калия 0,03568 г растворить в небольшом количестве дистиллированной воды в мерной колбе вместимость 1 л и довести объем раствора до метки.
0,001 н раствор 2,6-дихлорфенолиндофенола ( краска Тильманса ) . Навеску краски около 0,2 г растворить в 300 мл свежепрокипяченной теплой дистиллированной воды, добавить 20–30 капель 0,01 н раствора гидроксида калия или натрия и количественно перенеси в колбу вместимостью 1000 мл. Объем раствора довести до метки и отфильтровать. Титр раствора определить по йодноватокислому калию.
Определение титра раствора 2,6-дихлорфенолиндофенола по йодноватокислому калию. В мерной колбе вместимостью 50 мл растворить 1 мг кристаллической аскорбиновой кислоты в 30 мл раствора 2%-ной серной кислоты и довести объем до метки тем же раствором кислоты. В две конические колбы для титрования отобрать по 5 мл приготовленного раствора аскорбиновой кислоты. Раствор в одной колбе оттитровать 0,001 н раствором 2,6-дихлорфенолиндофенолом до появления розового окрашивания, не исчезающего в течение 30 с. Во вторую колбу добавить несколько кристалликов йодида калия (около 1–2 мг), 5 капель 1%-го раствора крахмала и оттитровать 0,001 н раствором йодноватокислого калия до появления едва заметного синего окрашивания.
Исходя из того, что 1 мл 0,001 н раствора йодноватокислого калия, а следовательно, и 2,6-дихлорфенолиндофенола, эквивалентен 0,088 мг аскорбиновой кислоты, рассчитать титр раствора 2,6–дихлор-фенолиндофенола ( Т, мг/мл) по аскорбиновой кислоте по формуле
T = 0 , 088 × V 1 V 2 ,
где 0,088 – количество аскорбиновой кислоты, соответствующее 1 мл 0,001 н раствора йодноватокислого калия, мг/мл;
V 1 – объем 0,001 н раствора йодата калия, израсходованного на титрование раствора аскорбиновой кислоты, мл;
V 2 – объем раствора 2,6-дихлорфенолиндофенола, израсходованное на титрование, мл.
Источник