Ифа метод определение витаминов

Ифа метод определение витаминов

Витамин В 12 и фолаты являются необходимыми компонентами при синтезе ДНК. Поэтому дефицит этих витаминов может вызывать нарушения в продукции, созревании и функциональном состоянии эритроцитов и лейкоцитов, вызывая мегалобластную анемию, с одной стороны, и изменения в нейропсихологических реакциях, с другой, причем последние могут проявляться независимо от наличия анемии. Витамин В12 синтезируется только микроорганизмами и поступает в организм человека и животных с мясной пищей. За всасывание витамина В12 ответственен внутренний “intrinsic” фактор в пищеварительном тракте. При его дефиците или отсутствии возникает пернициозная анемия. Источником фолатов являются овощи, фрукты и печень.

Структурно витамин В12 относится к кобаламинам, в состав которых входит корриновое кольцо, в центре которого находится атом кобальта, верхний лиганд, ковалентно связанный с кобальтом, и нуклеотидная боковая цепь. Фолиевая кислота относится к птероглютаминовым кислотам. Как витамин В12, так и фолаты имеют много дериватов. Среди известных витаминов кобаламины занимают первое место по структурной сложности и разнообразию, а по концентрации в организме — последнее. Однако, реакции, в которых они принимают участие, крайне важны для нормального метаболизма животных организмов. Это, прежде всего, реакция переноса метильных групп на гомоцистеин и участие в синтезе метионинсинтетазы, которая является одним из звеньев в каскаде реакций, ответственных за проведение нервных импульсов, а также реакция мутазного типа по превращению метилмеланила-КоА в сукцинил-КоА — ключевой стадии в метаболитических, и синтетических реакциях.

В связи с вышеуказанным, количественное определение витамина В12 и фолатов существенно как для гематологии, так и неврологии при проведения дифференциальной диагностики, назначении адекватной терапии и динамических наблюдений.

Поскольку содержание кобаламинов и фолатов в организме крайне незначительно, определение их возможно только современными высокочувствительными методами — радиоиммунными, энзимоиммунными и иммунофлюоресцентными. Большинство наборов, выпускаемых фирмами в данное время, приспособлено для автоматизированных “закрытых” систем и очень дороги, поэтому разработка относительно недорогого иммуноферментного метода, приспособленного для “открытой” системы, является весьма актуальной проблемой.

Мы решили применить твердофазный иммуноферментный метод, используя моноклональные антитела против витамина В12 и фолиевой кислоты производства фирмы Sigma.

Поскольку как витамин В12, так и фолаты являются гаптенами, для проведения иммуноэнзимного анализа требовалось получение конъюгатов этих соединений с бычьим сывороточным альбумином.

Получение конъюгатов проводили карбодиимидным методом. Для конъюгата витамина В12 использовали его карбоксильное производное, любезно предоставленное нам Рудаковой И.П., а для фолатов — фолиевую кислоту. Ниже мы приводим описание метода по получению конъюгатой Альб-В12 и Альб-фолат.

10 мг фолиевой кислоты (17,6мкмоль) и 10 мг карбоксилатного производного цианкобаламина (7 мкмоль) растворяли каждый в 2 мл абсолютного диметилформамида, и добавляли по 2 мг дициклогексилкарбодиимида(10 мкмоль) и по 5 мг N-гидроксисукцинимида(43 мкмоль). Реакционную смесь инкубировали в темноте в течение 3-х суток в случае фолиевой кислоты и 2-х — витамина В12 до выпадения кристаллов дициклогексилмочевины. Затем супернатант, содержащий N-гидроксисукцинимидилфолат добавляли к 20 мл раствора БСА (2,5мг/мл), а супернатант с N-гидрокси-сукцинимидилкобаламином — к 6,5 мл раствора БСА(10 мг/мл) в 0,1 М карбонатном буфере, рН 9,2. Реакцию конъюгирования проводили в течение 6 часов при комнатной температуре в темноте, после чего конъюгат диализовали в темноте при 4 ° С против 0,01М трис-хлоридного буфера, рН 7,2, содержащего 0,15М хлорида натрия для удаления несвязавшихся продуктов реакции( соответственно фолиевой кислоты и цианкобаламина). Степень модификации БСА фолиевой кислотой определяли спектрофотометрически, используя молярный коэффициент экстинкций 29100 М -1 см -1 при длине волны 297 нм. Она составляла 3 остатка на моль белка. Степень модификации БСА цианкобаламином определяли также спектрофотометрически, используя коэффициент экстинкции 8700 М -1 см -1 при l =550 нм. В нашем случае она составила 0,3 моля на моль белка.

Твердофазным носителем служили иммунологические планшеты фирмы Nunk, которые были сенсибилизированы растворами конъюгатов. Стандартные растворы получали из конъюгатов Альб-В12 и Альб-фолат, определяя их концентрацию спектрофотометрически, как указано выше. В данных системах был применен непрямой конкурентный метод иммуноферментного анализа с использованием моноклональных антител против витамина В12 и фолиевой кислоты. Количество связавшихся антител определяли, используя конъюгат анти-IgG человека с пероксидазой хрена /анти-IgG-ПХ/, по его связыванию с твердой фазой. Субстратом реакции служил ТМВ.

Была проведена работа по подбору эквивалентных концентраций всех реагентов, участвующих в реакции.

Ниже мы приводим условия постановки реакции с указанием подобранных разведений для всех реагентов.

Сенсибилизацию планшетов проводили конъюгатами Альб-В12 и Альб-фолат в разведении 1:20 в фосфатном буфере с БСА /ФБС/ в течение первых 3-х часов при 37 0 С, а затем в течение ночи в холодильнике. Затем планшеты были отмыты несколько раз ФСБ. Антигены, т.е. стандартные растворы и испытуемые образцы, предварительно прогревали при 100 0 С в растворе 0,3N NaOH с KCN и с дитиотретолом/ДТТ/ для перевода всех дериватов кобаламинов и фолатов в циан-форму и предотвращения денатурации при кипячении. Использовали следующие концентрации стандартных растворов: 1300 пг/мл, 650 пг/мл, 300 пг/мл, 150 пг/мл и 75 пг/мл — для витамина В12 и 20нг/мл, 10нг/мл, 5нг/мл и 2,5нг/мл — для фолатов.

Стандартные растворы и испытуемые образцы — 0,1 мл — помещали в специальные пробирки и добавляли по 0,1 мл раствора NaOH(0,3 N) c KCN(1мг/мл) и ДТТ (50мкл ДТТ на 6 мл раствора щелочи). Пробирки закрывали крышечками из фольги и помещали на 10 мин в кипящую водяную баню. Затем все пробы охлаждали и вносили по 0,1 мл в сенсибилизированные планшеты. Реакцию проводили в течение 12-14 часов при 4-6 0 , после чего планшеты снова отмывали, а затем вносили соответственно по 0,1 мл антител против витамина В12 в разведении 1:1000 и 0,1 мл антител против фолиевой кислоты в разведении 1:500. Планшеты снова помещали в холодильник на 12-14 часов, после чего их в очередной раз отмывали ФСБ. Затем во все лунки планшета вносили по 0,1 мл анти-IgG-ПХ в разведении 1:10000 и помещали в термостат на 2 часа, снова отмывали ФСБ и затем добавляли по 0,1 мл ТМВ, а после развития окраски через 10-15 мин реакцию закрепляли 4% H 2 SO 4 . Результаты спектрофотометрировали на приборе Titertek Multiskan при l 450 nm. На основании стандартных разведений строили кривую, по которой затем определяли концентрации исследуемых соединений в испытуемых образцах.

Ниже приведены стандартные кривые, полученные при использовании разработанного нами метода. Для проверки набора мы использовали также фирменные стандартные разведения, любезно предоставленные нам Деминой Д.Г. Кривая с фирменными разведениями аналогична кривой с нашими реактивами (рис.1,2).

Проверка набора по контрольным сывороткам также дала положительные результаты: в сыворотке с содержанием витамина В12 900- 1000 пг/мл получено значение 1200 пг/мл, а в сыворотке с уровнем В12 200-250 пг/мл мы получили 180 пг/мл. Подобная сходимость была получена и в отношении определения фолатов: при 16-20нг/мл — 18,5нг/мл, а при 2-4нг/мл — 3,5нг/мл. Кроме того, в нескольких образцах сыворотки определение витамина В12 было проведено нами и в центральном диагностическом центре. Результаты были сходными: 1070 пг/мл — в диагностическом центре и 1200 пг/мл у нас, 250 пг/мл в диагностическом центре и 225 пг/мл с нашим набором.

Всего определение витамина В12 и фолиевой кислоты было проведено в образцах крови 25-ти доноров и 250-ти больных с различными видами анемий. Средние значения витамина В12 в норме составило 700 ± 150 пг/мл (350-900), среднее значение фолиевой кислоты — 7,5 ± 2,3 нг/мл(5,8-10), что соответствует литературным данным.

У больных с железодефицитной анемией /ЖДА/ до лечения уровень витамина В12 составлял 926 ± 205,5 пг/мл, а после проведения ферротерапии при нормализации уровня Нв снизился до 276 ± 49,9 пг/мл Уровень фолатов до терапии был 15,6 ± 5,3 нг/мл, а после терапии — 9,0 ± 2,2 нг/мл. Данные результаты вполне логичны, поскольку эти витамины потребляются при синтезе гемоглобина. У больных с лимфопролиферативными заболеваниями наблюдались повышенные значения витамина В12, в отдельных случаях даже до 2000 пг/мл и пониженное содержание фолатов — до 2,5 нг/мл. У больных с миелопролиферациями отмечено понижение как витамина В12, так и фолиевой кислоты. Полученные нами результаты согласуются с литературными данными.

Таким образом, разработанная нами система для определения витамина В12 и фолатов на основе “открытого” иммуноферментного метода может быть использована при диагностике и динамическом лечении различных форм анемий.

Источник

Тест-система RIDASCREEN ® FAST Vitamin B12

Набор RIDASCREEN ® FAST Vitamin B12 представляет собой для иммуноферментного анализа реагентами, выпускается серийно под контролем системы качества ISO9000 для количественного определения витамина B12 сухом молоке, молочных коктейлях, зерне, муке, витаминизированных продуктах питания, соках, кормах, премиксах препаратах, в соответствии с ГОСТ Р 53861-2010.

Определение витамина В12 сухом молоке, молочных коктейлях, зерне, муке, витаминизированных продуктах питания, соках, кормах, премиксах препаратах

Витамин B12 (другое название – цианокобаламин) играет существенную роль позвоночных. высокой биологической активностью, является фактором роста, необходим для нормального кроветворения эритроцитов, оказывает благоприятное влияние печени нервной системы. Кроме того, витамин B12 необходим для нормального усвоения фолиевой кислоты, которая играет важную роль аминокислот нуклеотидов. человека витамин B12 синтезируется микрофлорой кишечника, откуда поступает накапливаясь количествах Синтезом потребность организма В12 полностью дополнительные количества должны поступать животного происхождения препаратами. Дефицит витамина B12 ведет заболеваниям.

В рутинной практике для определения витамина B12 продуктах используются микробиологические методы, жидкостная хроматография высокого давления, тонкослойная хроматография метод анализа. Последний метод (ИФА) характеризуется простотой, высокой чувствительностью, специфичностью выполнения анализа.

Методика измерений массовой концентрации витамина B12 в слабоалкогольных напитках методом иммуноферментного анализа с помощью тест-системы RIDASCREEN ® FAST Vitamin B12 зарегистрирована в Федеральном Информационном Фонде по обеспечению единства измерений под номером ФР.1.31.2013.14281.

Смежные продукты:

Стандарты и стандартные растворы витаминов
Тест-система RIDASCREEN ® FAST Folic Acid
Тест-системы серии Vita Fast ® для определения тиамина (B1), рибофлавина (В2), ниацина (В3) , пантотеновой кислоты (В5) , пиридоксина (В6), биотина (В7) , фолиевой кислоты (В9), цианкобаламина (В12), аскорбиновой кислоты (C), инозитола.
Вспомогательный набор VitaFast ® Accessory Kit
Тест-система Yellow line Roche Diagnostics L-Аскорбиновая кислота

Источник

Научная электронная библиотека

Морозова В. С., Габрильянц О. А., Мягкова М. А.,

3.2.3. Иммуноферментный метод (ИФА)

Иммуноферментный анализ (сокращённо ИФА, англ. enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA) – лабораторный иммунологический метод качественного или количественного определения различных соединений, макромолекул, вирусов и пр., в основе которого лежит специфическая реакция антиген-антитело. Выявление образовавшегося комплекса проводят с использованием фермента в качестве метки для регистрации сигнала.

Твердофазный ИФА был предложен в 1971 году. Основные принципы твердофазного ИФА, независимо от модификации, заключаются в следующем:

1. На 1 этапе реакции адсорбируют антигены или антитела на твердой фазе. При этом не связавшиеся с твердой фазой реагенты легко удаляются отмыванием.

2. В сенсибилизированных лунках инкубируют исследуемый образец. В лунках с положительным контролем – стандартные реагенты. При этом на поверхности твердой фазы формируются иммунные комплексы. Несвязавшиеся компоненты удаляют отмыванием.

3. При добавлении конъюгата антитело-фермент или антиген-фермент и связывании его с иммобилизованным иммунным комплексом активный центр фермента остается доступным для последующего взаимодействия с субстратом. Инкубация субстрата в лунках с иммобилизованным конъюгатом приводит к развитию цветной реакции. Эту реакцию можно остановить на нужной стадии, выраженность окрашивания можно оценить визуально или по оптической плотности.

Из-за разнообразия объектов исследования – от низкомолекулярных соединений до вирусов и бактерий, и многообразия условий проведения ИФА существует большое количество вариантов этого метода.

Одним из принципов классификации методов ИФА является их разделение по типу проводимых на каждой из иммунохимических стадий реакций. В соответствии с эти все методы можно разделить на две группы –
гомогенные и гетерогенные. Если в ходе выполнения анализа все реакции, включая ферментативную стадию, протекают в растворе, то метод является гомогенным. Гетерогенный ИФА объединяет методы, в которых анализ проводится в двухфазной системе, при этом разделение на фазы может происходить на любой стадии определения [16].

В настоящее время EMIT (гомогенный ИФА) широко распространен во всем мире наряду с твердофазным ИФА (тИФА). EMIT по сравнению с тИФА является более экспрессным (до 2-х минут) и менее трудоемким, хотя менее чувствительный, и поэтому используется только в качественном анализе.

Возможна также классификация по типу иммунохимического взаимодействия на первой стадии анализа (в которой происходит связывание определяемого вещества). Если в системе присутствуют только анализируемое соединение и соответствующие ему центры связывания (антиген и специфические антитела), то метод является неконкурентным. Если же на первой стадии в системе одновременно присутствует анализируемое соединение и его аналог (меченное ферментом анализируемое соединение или анализируемое соединение, иммобилизованное на твердой фазе), конкурирующие за ограниченное количество центров специфического связывания, то метод является конкурентным.

Рис. 10. Конкурентный (а) и неконкурентный (б) ИФА

Примером неконкурентного формата ИФА является «сэндвич»-метод. К носителю с иммобилизованными антителами добавляют раствор, содержащий анализируемый антиген. В процессе инкубации на первой стадии на твердой фазе образуется комплекс антиген-антитело. Затем носитель отмывают от несвязавшихся компонентов и добавляют меченные ферментом специфические антитела. После вторичной инкубации и удаления избытка конъюгата антител с ферментом определяют ферментативную активность носителя, которая пропорциональна начальной концентрации исследуемого антигена. На стадии выявления специфического иммунокомплекса антиген оказывается как бы зажатым между молекулами иммобилизованных и меченных антител, что послужило поводом для широкого распространения названия «сэндвич»-метод.
Ферментативная реакция (цветная реакция) проходит в присутствии перекиси водорода и субстрата, представленного неокрашенным соединением, которое в процессе пероксидазной реакции окисляется до окрашенного продукта реакции на заключительном этапе проведения исследования. Интенсивность окрашивания зависит от количества выявленных специфических антител. Результат оценивается спектрофотометрически или визуально.

«Сэндвич»-метод может быть использован для анализа только тех антигенов, на поверхности которых существуют, по крайней мере, две антигенные детерминанты. На этом формате основано большое количество тест-систем для иммуноферментной диагностики различных инфекций: ВИЧ-инфекция, вирусные гепатиты, цитомегаловирусная, герпесная, токсоплазменная и другие инфекции.

Другим типом классификации схем ИФА является разделение по типу определения концентрации анализуемого вещества:

1) прямое определение образовавшихся иммунокомплексов (аналитический сигнал прямо пропорционален концентрации определяемого вещества) – прямой ИФА;

2) определение концентрации оставшихся свободными, т.е. не вступившими в реакцию компексообразования антител – непрямой ИФА.

Так, среди конкурентных схем твердофазного ИФА существует два основных формата:

Прямой конкурентный формат ИФА использует в качестве меченного ферментом реагента одного из участников иммунохимической реакции (рис. 3) – определяемое соединение или специфический к нему диагностический реагент (антитела). В результате схема ИФА состоит из 3-х стадий:

– сорбции (иммобилизации) специфических антител, либо конъюгата антигена,

– аналитической стадии: конкурентной реакция Аг-Ат с участием меченого ферментом реагента (антигена или антител),

– фермент-субстратной реакции, в результате которой образуется окрашенный (или люминисцентный) продукт.

Например, на полистирольный планшет иммобилизуют специфические антитела (рис. 11 в) иммобилизованые на твердой фазе специфические антитела. На второй стадии к иммобилизованным антителам добавляют раствор, содержащий определяемое вещество и фиксированную концентрацию меченого антигена, инкубируют и после отмывки носителя от несвязавшихся компонентов регистрируют ферментативную активность образовавшихся на твердой фазе специфических иммунных комплексов. В этой схеме меченый ферментом и немеченый антиген конкурируют за связывание с иммобилизованными специфическими антителами.

Рис. 11. Виды конкурентного ИФА:
а – непрямой конкурентный ИФА с иммобилизацией конъюгата антигена с высокомолекулярным веществом и использованием меченых антивидовых антител; б – непрямой конкурентный ИФА с иммобилизацией конъюгата антигена с высокомолекулярным веществом и использованием меченых специфических антител; в – прямой конкурентный ИФА с иммобилизацией специфических антител и использованием меченого антигена (аналита)

Преимуществом прямой схемы является небольшое число стадий, что позволяет легко автоматизировать анализ. К недостаткам схемы относятся сложность методов синтеза ферментных конъюгатов, а также возможное влияние компонентов образца на активность фермента.

В непрямом конкурентном формате ИФА используются меченные ферментом антитела (специфические или вторичные) и иммобилизованный на твердой фазе конъюгат антиген-белок-носитель
(рис. 11 а, б). Непрямая схема с использованием меченых антивидовых антител является одной из наиболее распространенных схем ИФА (рис. 11 а). На поверхности носителя иммобилизуют конъюгат антиген-белок, к которому добавляют раствор, содержащий определяемый антиген и фиксированную концентрацию немеченых специфических антител, инкубируют и после удаления несвязавшихся компонентов добавляют фиксированную концентрацию меченых антивидовых антител. После инкубации и отмывки носителя детектируют ферментативную активность образовавшихся на твердой фазе специфических иммунных комплексов. Величина аналитического сигнала в этом случае находится в обратно-пропорциональной зависимости от концентрации определяемого антигена.

Применение универсального реагента – меченых антивидовых антител – даёт возможность выявлять антитела к разным антигенам. Кроме того, анализируемый образец и меченый реагент вводятся в систему на разных стадиях, что устраняет влияние различных эффекторов, содержащихся в образце, на каталитические свойства ферментной метки. Однако такая схема анализа усложняет его проведение из-за введения дополнительных стадий.

ИФА наркотических веществ и их метаболитов в биологических жидкостях и тканях широко используется в ХТЛ, бюро судмедэкспертизы, клинико-диагностических лабораториях, медицинских центрах. Чаще всего применяется полуколичественный вариант методики, т.к. в большинстве случаев необходимо дать заключение о том, превышает ли уровень метаболитов ПАВ в образце определенную пороговую концентрацию. Однако метод ИФА может использоваться (и используется в некоторых случаях) для количественного определения метаболитов ПАВ с высокой чувствительностью – до 10–9 г/л.

Отдельно следует выделить иммунохимический метод выявления фактов употребления наркотиков в отдаленные промежутки времени (до 4 месяцев после последнего употребления ПАВ), основанный на определении антител к наркотическим веществам в крови человека [4, 5]. Данный метод использует прямую неконкурентную схему ИФА.

Компоненты, используемые в ИФА

Ферментные метки обладают чрезвычайно мощным каталитическим действием, одна молекула фермента может реагировать с большим количеством молекул субстрата. Таким образом, фермент, присутствующий в ничтожных количествах, можно выявить и количественно определить по образованию продуктов катализируемой им реакции. Другое преимущество применения ферментов в качестве меток обусловлено наличием в молекуле многочисленных функциональных групп (сульфгидрильных, карбоксильных, остатков тирозина и др.), через которые можно ковалентно присоединить молекулы лиганда.

В ИФА может использоваться не менее 15 различных ферментов. Наибольшее применение, в соответствии с вышеназванными требованиями, нашли пероксидаза хрена (ПХ), щелочная фосфотаза (ЩФ) и β-D-галактозидаза. Все три стабильны и катализируют высокочувствительные реакции. Кроме того, продукты, получаемые в результате реакций, катализируемых этими ферментами, в зависимости от используемого субстрата, могут выявляться не только колориметрическими методами, но также флуоресцентными методами. Другие ферменты используются значительно реже. Это объясняется их более низкой в сравнении с ПХ и ЩФ удельной активностью.

Выбор субстрата в первую очередь определяется используемым в качестве метки ферментом, так как реакция фермент-субстрат высоко специфична.

Чаще используют хромогенные субстраты, которые, разрушаясь, образуют окрашенное вещество. Перспективным является использование высокоэнергетических субстратов – флуоресцентных, хемилюминесцентных.

3. Антигены и антитела.

Аг и Aт, используемые в ИФА, должны быть высокоочищенными и высокоактивными. Кроме того, Аг должны обладать высокой антигенностью, оптимальной плотностью расположения и количеством антигенных детерминант и гомогенностью. Многие синтетические и рекомбинантные Аг вирусов и бактерий хорошо себя зарекомендовали при использовании в ИФА. Это существенно повысило специфичность и воспроизводимость метода за счет сведения к минимуму перекрестных реакций.

Одним из наиболее важных реагентов в ИФА являются антитела. Чувствительность ИФА зависит от концентрации, активности и специфичности используемых антител. Используемые антитела могут быть поли- или моноклинальными, различного класса (IgG или IgM) и подкласса (IgGl, IgG2), антиаллотипическими или антиидиотипическими. При низкой аффинности Ат распад комплекса Аг-Ат приводит к удалению связанного Аг из системы. Чувствительность и специфичность метода повышается при использовании моноклональных антител. В этом случае появляется возможность обнаруживать низкие концентрации Аг (Aт) в испытуемых образцах.

4. Получение конъюгата.

Конъюгат – это антиген или антитело, «сшитые» с ферментной меткой или белком-носителем. Получение коньюгата – один из важных этапов разработки ИФА.

При синтезе конъюгата с ферментом подбирают такой оптимальный метод введения ферментной метки, чтобы оба компонента конъюгата сохраняли свою биологическую активность: фермент – способность взаимодействовать с субстратом, а антиген или антитело – антигенность и антигенсвязывающую активность, соответственно. Наличие меченого, высокоочищенного антигена позволяет использовать конкурентные методы ИФА. Однако антигены разнообразны по своим физико-химическим свойствам и строению, а значит невозможно разработать универсальные методики для получения конъюгата с антигеном. В этом случае получение конъюгата антигена с ферментом представляет собой отдельную сложную задачу. Приготовление меченых антител для ИФА методически более доступно.

Конъюгирование фермента с иммунохимически активными белками производится различными методами: химическая сшивка, ковалентное связывание молекулы фермента с Аг или Aт и образование соединений через нековалентные связи, например, когда связь между ферментом и Аг или Aт осуществляется иммунологически, через взаимодействие антиген-антитело.

В качестве твердой фазы для проведения ИФА можно применять различные материалы: полистирол, поливинилхлорид, полипропилен и другие вещества. Твердой фазой могут служить стенки пробирки, 96-луночные и др. планшеты, шарики, бусины, а также нитроцеллюлозные и другие мембраны, активно сорбирующие белки.

Иммобилизация антигена или антител на твердой фазе возможна тремя путями:

– пассивная адсорбция, основанная на сильных гидрофобных взаимодействиях между белками и синтетической поверхностью;

– ковалентное прикрепление к твердой фазе;

– иммунохимическое и др. (нековалентное и неадсорбционное присоединение).

Пассивная адсорбция белков широко используется при проведении ИФА на платах для титрования, на нитроцеллюлозных мембранах. Пассивная адсорбция идет по принципу насыщения и коррелирует с молекулярной массой адсорбируемого вещества. В стандартных наборах ИФА используются 96-тилуночные прозрачные полистирольные планшеты.

Рис. 12. Набор для ИФА-определения наркотических еществ в биологических жидкостях: – планшет с нанесенным антигеном; 2 – положительный и отрицательный контрольный образец; 3 – реагент для выявления образовавшихся иммунных комплексов; 4 – растворы буфера для приготовления анализируемых образцов; 5 – раствор буфера для проведения фермент-субстратного окрашивания; – раствор для остановки реакции окрашивания субстрата; – инструкция по применению

Свободные сайты на поверхности твердой фазы, не связавшиеся с сорбируемым агентом, могут фиксировать в ходе теста другие молекулы, в том числе и конъюгаты, что приводит к повышению фонового сигнала. Для предотвращения неспецифического связывания после иммобилизации на твердую фазу основного материала проводят обработку нейтральными для теста веществами. Наиболее популярные блокирующие агенты – бычий сывороточный альбумин (БСА), казеин и др. Выбор блокирующего агента и условия проведения этого этапа зависят от типа твердой фазы, чувствительности системы.

Готовый набор для ИФА-определения наркотических веществ в биологических жидкостях выглядит следующим образом (рис. 12).

Источник