Функция витаминов группы b у бактерий

Витамин В12 оказался важным веществом для всех микроорганизмов

ВИТАМИН В12 — КЛЮЧЕВОЕ ЗВЕНО В РЕГУЛЯЦИИ МЕТАБОЛИЗМА ФОЛИЕВОЙ КИСЛОТЫ, УБИХИНОНА И МЕТИОНИНА

ВИТАМИН В12 ОКАЗАЛСЯ ВАЖНЫМ ДЛЯ ВСЕХ МИКРООРГАНИЗМОВ

Ученые выяснили, что витамин B12 играет важную роль в функционировании микробных сообществ — целостных структур, которые оказывают влияние на выработку энергии и играют большую роль в производстве продуктов питания. От них во многом зависит состояние окружающей среды и здоровье человека, а также многие другие процессы. Синтезировать этот витамин способны лишь некоторые микроорганизмы, но потребность в нем испытывают абсолютно все из них.

Прим. ред.: Как известно, молекула витамина В12 — самая большая и громоздкая среди молекул всех витаминов, содержащая атом кобальта, ни один другой витамин в живой природе не содержит атомов металлов. Подробнее о витамине В12, или вернее, о группе кобальтсодержащих биологически активных веществ, называемых кобаламинами, см. подробнее в разделе Витамин В12 .

Ученые из Тихоокеанской северо-западной национальной лаборатории (США) взяли для исследования небольшую часть микробиального мата из озера Хот-Лейк. Оно находится в Оровилле, штат Вашингтон, рядом с канадской границей (прим. ред.: Бактериальные маты – это биоценозы, состоящие из прокариот и располагающиеся на дне водоемов или в их прибрежной зоне. По форме наиболее похожи на плёнки плесени).

Постоянная гонка за так называемыми благами цивилизации — деньгами, нефтью, высокоскоростным доступом в интернет, чашкой утреннего кофе, формирует мир, в котором мы живем. Аналогичную проекцию можно применить и к микромиру. Только особой ценностью в этом мире будет являться не нефть, а, как установили ученые, витамин B12. Синтезировать этот витамин способны лишь некоторые микроорганизмы, но потребность в нем испытывают абсолютно все из них.

Полученные в ходе исследования данные подтверждают идею о том, что B12 помогает формировать микробные сообщества — целостные структуры, которые оказывают влияние на выработку энергии и играют большую роль в производстве продуктов питания. От них во многом зависит состояние окружающей среды и здоровье человека, а также многие другие процессы.

«Витамин B12 имеет особое значение для микробных сообществ. Степень его значимости даже больше, чем считалось ранее», — говорит химик Аарон Райт (Aaron Wright), автор научной статьи, опубликованной в интернет-издании Proceedings of the National Academy of Sciences. — «Мы изучаем и открываем функции, которые он контролирует. На основании всего этого можно с уверенностью заявить о его первостепенной важности для микробных сообществ».

Группа ученых под руководством Райта исследовала бактерию, известную как Halomonas sp. HL-48. Это один из малораспространенных поставщиков витамина B12 в своем микробном сообществе. Образец, использованный для исследования, взят из бактериального мата озера Хот-Лейк, находящегося на севере штата Вашингтон. Данный микробный мат насчитывает несколько десятков различных организмов, которые сосуществуют вместе и обмениваются питательными веществами, такими как углерод и кислород.

Исследователи выяснили, что витамин B12 контролирует важные гены микробов и ферменты, участвующие в формировании ДНК и белков. Но некоторые специалисты продвинулись глубже в своей работе и обнаружили признаки того, что B12 оказывает на жизнедеятельность микроорганизмов еще более значительное влияние.

Команда Райта обнаружила, что В12 взаимодействует более чем с четырьмя десятками различных бактериальных белков. Они обнаружили, что В12 занимает центральное место в процессах регуляции обмена фолиевой кислоты (витамина В9), убихинона (кофермент Q, также известный как кофермент Q10 или коэнзим Q10) и метионина — вещества, играющих ключевую роль в способности микробных клеток генерировать энергию, синтезировать белки, восстанавливать ДНК и расти. Данные о метионине – незаменимой серосодержащей аминокислоте, свидетельствуют о расширении влияния В12 по сравнению с тем что было известно о нём ранее.

По результатам исследования также стало известно, что витамин способен изменять информацию, которую он передает генам, в зависимости от времени суток, что неудивительно, ввиду того, что на жизнедеятельность микроорганизмов в огромной степени влияет свет (прим. ред.: напомним, что исследуется часть микробиального мата из озера).

Структуры веществ, в регуляции метаболизма которых участвует В12

«Для любого организма выработка витамина B12 — очень энергозатратный процесс. На него уходит много энергии, так как в процессе синтеза микробам приходится выполнять более 30 биохимических превращений. Это говорит о том, что данное вещество является весьма ценным и выполняет важные функции», — делится своими выводами Райт.

Для проведения экспериментов ученые создали химический аналог витамина B12, который работает так же, как и природное вещество, но отслеживать его взаимодействие с живыми клетками гораздо проще. После проведения анализа сходства сравнительных характеристик белкового профиля исследователи пометили молекулы, чтобы можно было точно распознать моменты их активности. Затем с помощью масс-спектрометрии была проведена идентификация интересующих ученых белков.

Прим. ред.: В заключение хочется отметить, что проведенные исследования, раскрывающие роль витамина B12 в регуляции метаболизма фолиевой кислоты, убихинона и метионина, а также участие В12 в производстве и поддержке новых клеток, синтезе и репарации ДНК, указывают на его исключительную жизненную важность для здоровья человека.

Напомним также, что если не уделять должного внимания адекватному присутствию В12 в рационе питания, то низкий уровень данного витамина может привести к серьезным неврологическим проблемам, а также нарушению производства красных кровяных телец. Одним из признаков такого состояния является ощущение покалывания, напоминающее удар током — это связано с низким уровнем кислорода. К другим симптомам дефицита В12 относятся: головокружение, необъяснимая усталость, бледность, мышечная слабость, плохое зрение, забывчивость, анемия, нарушения нервной системы, проблемы с менструальным циклом, диарея стоматит, потеря веса

Витамин B12 особенно важен для беременных. По данным исследования, проведенного Норвежским университетом науки и техники, у женщин с дефицитом B12 на 21% выше риск преждевременных родов.

Основной причиной В12-дефицитного состояния является отсутствие в рационе питания пищи животного происхождения или нарушения в работе ЖКТ. В связи с этим актуальным является использование в качестве источника получения В12 пробиотических продуктов на основе продуцентов В12 – пропионовокислых бактерий . К ним относятся как непосредственно бактериальные концентраты в виде биодобавок к пище, так и продукты, ферментированные заквасками ПКБ. Например, при сквашивании молока закваской активизированных культур пропионовокислых бактерий, содержание витамина В12 в готовом продукте может достигать более 1 грамма на 1 литр. При этом нормализуется работа ЖКТ, т.к. пробиотические микроорганизмы непосредственно регулируют и положительно влияют на процессы кишечного всасывания.

Источник

Синтез витаминов бифидобактериями

ВИТАМИН СИНТЕЗИРУЮЩАЯ СПОСОБНОСТЬ БИФИДОБАКТЕРИЙ

Бифидобактерии для геродиетического питания

Старение населения – одна из доминирующих тенденций ХХI в. В России число пожилых людей и их доля в общей численности населения, как и во всем мире, постоянно возрастает. Так, по данным экспертов Управления статистики населения и здравоохранения Росстата РФ количество пожилых людей старше 65 лет составляет 13% от общего числа жителей (согласно классификации ООН, страна считается старой, если в ней доля жителей старше 65 лет составляет более 7%). Мужчины живут значительно меньше женщин, и среди тех, кто старше 60 лет, женщин в 2,5 раза больше [4].

Для такой значительной части населения важнейший фактор здоровой старости – это рациональное питание. Правильно организованное питание является мощным средством воздействия на процессы старения и предупреждения преждевременного развития изменений и нарушений в организме человека.

Вклад питания в развитие заболеваний сердечно-сосудистой системы, остеопороза, диабета, ожирения, некоторых форм злокачественных новообразований составляет от 30 до 50% [6].

При рациональном питании пожилых людей с учетом возрастных патологических изменений желудочно-кишечного тракта необходимо соблюдение таких принципов геродиетики, как обогащение рационов продуктами, нормализующими кишечную микрофлору; рационализация режима питания; использование пищевых продуктов, достаточно легко подвергающихся действию пищеварительных ферментов [5]. Прим.:

Геродиетические продукты питания (gerodietetic food products) [греч. geron — старик и diaita — образ жизни] — продукты питания, предназначенные для стареющего организма и способствующие задержке процессов старения. Напр., молочно-кислые продукты со специальной бактериальной культурой, мясорастительные и рыборастительные смеси и др.

Доминирующими таксономическими группами бактерий, в норме колонизирующими интестинальный тракт человека, являются бифидобактерии, лактобактерии, бактероиды и клостридии.

Бифидобактерии. Из 24 видов, составляющих согласно современной классификации род Bifidobacterium, чаще других выделяются из кишечника здоровых людей и считаются наиболее физилогическими для организма человека – B. bifidum, B. longum, B. adolescentis, B. breve и B. infantis [13]. Причем виды B. longum и B. аdolescentis преобладают преимущественно у взрослых людей.

Таким образом, при любом заболевании, ассоциированном с микроэкологическими нарушениями, в том числе бактериемии различной этиологии, комплекс лечебных мероприятий должен обязательно включать восстановление нормобиоценоза с помощью пробиотиков на основе физиологической микрофлоры, прежде всего бифидобактерий и лактобацилл. Перспективным в настоящее время можно считать направление, связанное с получением продукции на молочной основе синбиотической направленности. Это продукты и БАД, сочетающие в себе про- и пребиотики. Подобное сочетание позволяет создавать новые виды лечебных, диетических, функциональных продуктов или специализированных препаратов [8-12, 14]. Бесспорно, что оптимальной основой для пробиотических продуктов являются бифидобактерии.

Целью работы является изучение витаминсинтезирующей способности бифидобактерий

Объекты и методы исследования

В целях изучения витаминсинтезирующей способности бифидобактерий в качестве объектов исследований были выбраны чистые культуры бактерий: штаммы Bifidobacterium longum ДК-100 и Bifidobacterium adolescentis DSM 283, полученные из Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов ФГУП ГосНИИ «Генетика». Культур микроорганизмов были активизированы уникальным биотехнологическим методом, разработанным в ВСГУТУ. Для культивирования пробиотических микроорганизмов применяли питательную среду на основе осветвленной творожной сыворотки с внесением ростовых компонентов. Была изучена способность к синтезу водорастворимых витаминов – В1 (тиамин), В3 (ниацин, никотиновая кислота, никотинамид, витамин PP), В5 (пантотеновая кислота), В6 (пиридоксин) отдельных культур B. longum ДК-100, B. adolescentis DSM 283 и их сочетаний в соотношении 3:7, 4:6 соответственно. Содержание витаминов определяли методом капиллярного электрофореза [1]. Идентификацию и количественное определение анализируемых витаминов проводили с помощью установленного программного обеспечения.

Результаты и их обсуждение

У лиц пожилого (61-74 года) и старческого (75 лет и старше) возраста постепенно ухудшаются переваривающая и всасывающая способность слизистой оболочки кишечника. При атрофии ворсинок кишечника снижается активность пищеварения и всасывания компонентов пищи. Следствием этого является дефицит в организме белков, витаминов, микро- и макроэлементов. Известно, что с возрастом витамины приобретают все большее значение в качестве активаторов обмена веществ, стимуляторов защитных систем организма. Результаты исследования способности культур B. longum ДК-100, B. adolescentis DSM 283 и их сочетаний в соотношении 3:7, 4:6 к синтезу витаминов представлены в таблице 1.

Таблица 1. Содержание витаминов в заквасках бифидобактерий

Источник

Микробиологический синтез витамина В12

СИНТЕЗ ВИТАМИНА В12

Общая информация о получении витамина В12

Из всех витаминов, методом микробиологического синтеза производят в основном витамин В12 и его коферментную форму. Продуцентами в этом процессе служат пропионовокислые бактерии . Для получения кормовых концентратов, содержащих витамин В12, на отходах бродильной промышленности (послеспиртовые, ацетоно-бутиловые барды и др.) применяют комплекс метанообразующих бактерий.

Физиология прокариот (бактерий) — центральное направление микробиологии, формирующее целостное представление о жизнедеятельности организма. Изучение физиолого-биохимических свойств практически значимых микроорганизмов актуально в плане решения общечеловеческой задачи — улучшения качества жизни. Пропионовокислые бактерии (ПКБ) имеют разнообразное практическое применение. Достаточно напомнить, что Propionibacterium freudenreichii subsp. shermanii — основная и незаменимая культура, используемая в мировом производстве «твёрдых» сыров , а в России — и в производстве витамина B12 , однако области применения ПКБ этим не ограничены. Поэтому биология ПКБ находится под постоянным «прицелом» специалистов разных профилей. Регулярно проводится международный тематический симпозиум «Propionibacteria». В различных исследованиях значительное внимание уделено роли кобальта и кобаламина (истинного витамина В12) в биосинтезе корриноидов — соединений группы витамина В12. Также сегодня весьма актуально и изучение значения ионов кобальта и корриноидов для жизнедеятельности самих пропионовокислых бактерий.

Молекулярная структура кобаламинов (витамина В12)

Витамин B12 — первое органометаллическое соединение, выделенное из биологической системы. Из неполимерных органических соединений имеет наиболее сложное строение, изображенное на рисунке. Молекула состоит из двух почти планарных циклических структур и линейного участка. Металл Со+3 связан с макроциклом, сильно напоминающим порфириновое ядро гема. Это тетрапиррольная структура, но имеющая ту особенность, что вместо метановых мостиков, связывающих 4 пиррольных кольца, кольца А и D непосредственно связаны. Вторая кольцевая структура — азотистое основание — 5,6-диметилбен-зимидазол (5,6 ДМБ>. 5,6 ДМБ соединен с первой кольцевой системой гетерогенной боковой цепью, состоящей из N-амино-2-пропанола (изопропанола), этерифицированного фосфатом 3-мононуклеотида, связанного с основанием 5,6 ДМБ Na-гликозидной связью.

Структура витамина В12 не только очень сложная, но содержит некоторые необычные части: 1) корриновая структура ранее не была известна в органической химии (до открытия витамина В12 в 1948 г. независимо Риксом и Смитом); 2) Na-гликозидная связь встречается в природе очень редко и обнаружена лишь в нескольких соединениях, содержащих рибозо-3-фосфат; 3) 5,6 ДМБ тоже принадлежит к уникальным соединениям и встречается в природе только в составе кобаламинов.

Атом кобальта имеет 6 координационных связей; 4 из них заняты пиррольными кольцами. Одна — N-3-5,6 ДМБ и последняя — верхним лигандом (У), природа которого может варьировать. В коммерческом витамине В12 (цианкобаламине) лиганд -CN-группа (артефакт процесса выделения).

In vivo чаще всего встречаются дезоксиаденозильная группа (Co-B12-I), метильная группа (метилкобаламии, СН3-B12-CoB-II) или оксогруппа (оксокобаламин). Кроме этих соединений, известных как кобаламины, есть другие корриноидные соединения с иным нуклеотид-аным основанием.

Продуценты витамина B12.

В природе витамин В₁₂ и родственные корриноидные соединения находят в клетках микроорганизмов, в тканях животных и некоторых высших растениях (горох, лотос, побеги бамбука, листья и стручки фасоли). Однако происхождение витамина В₁₂ в высших растениях окончательно не установлено. Такие низшие эукариоты, как дрожжи и мицелиальные грибы, корриноиды, по-видимому, не образуют. Организм животных не способен к самостоятельному синтезу витамина. Среди прокариот способность к биосинтезу корриноидов широко распространена. Активно продуцируют витамин В₁₂ представители рода Propionibacterium. Природные штаммы пропионовокислых бактерий образуют 1,0—8,5 мг/л корриноидов, но получен мутант P. shermanii M.- 82, с помощью которого получают до 58 мг/л витамина. В семействе Propionibacteriaceae есть и другие представители, способные к высокому накоплению витаминами В12 в клетках. Это, прежде всего, Eubacterium limosum (Batyribacterium retteerii). Как продуценты витамина практический интерес имеют многие представители актиномицетов и родственных микроорганизмов. Истинный витамин В₁₂ в значительных количествах синтезирует Nocardia rugosa. Путем мутаций и отбора получен штамм N. rugosa, накапливающий до 18 мг/л витамина В₁₂. Активные продуценты витамина обнаружены среди представителей рода Micromonospora: M. purpureae, M. echinospora, M. halophitica, M. fusca, M. chalceae.

Высокой кобаламинсинтезирующей активностью обладают метаногенные бактерии, например, Methanosarcina barkeri, M. vacuolata и отдельные штаммы галофильного вида Methanococcus halophilus. Последний организм синтезирует более 16 мг корриноидов на грамм биомассы. Столь высокого содержания корриноидов не отмечено ни у одного другого из изученных микроорганизмов. Причина высокого содержания корриноидов у метаногенных бактерий не установлена. Корриноиды синтезируют строго анаэробные бактерии из рода клостридий. У Clostridium tetanomorphum и Cl. Sticklandii аденозилкобаламин входит в состав ферментных систем, катализирующих специфические реакции изомеризации таких аминокислот, как глутаминовая, лизин и орнитин. В значительных количествах образуют витамин В₁₂ ацетогенные клостридии Cl. thermoaceticum, Cl. formicoaceticum и Acetobacter woodi, синтезирующие ацетат из СО₂. Известны активные продуценты витамина B₁₂ у псевдомонад, среди которых лучше других изучен штамм Pseudomonas denitrificans MB-2436 — мутант, дающий на оптимизированной среде до 59 мг/л корриноидов. Корриноиды синтезируют Rhodopseudomonas, фототрофные пурпурные бактерии Rhodobacter sphericus , Rh. Capsulatus, Rhodospirillum rubrum, Chromatium vinosum и ряд других видов. Наряду с витамином В₁₂ они образуют бескобальтовые корриноиды, роль которых для продуцентов не установлена. Значительные количества витамина В₁₂ образует цианобактерия Anabaena cylindrica, одноклеточные зеленые водоросли Chlorella pyrenoidosae и красные водоросли Rhodosorus marinus. Продуценты витамина B12 культивируют в средах, приготовленных на основе пищевого сырья: соевой муки, рыбной муки, мясного и кукурузного экстракта. В последние годы выявлены микроорганизмы, образующие высокие качества корриноидов при утилизации непищевого сырья.

Получение и применение витамина В12

Мировая продукция витамина В₁₂ составляет 9 — 11 тыс. кг в год; из них 6,5 тыс кг используют на медицинские цели, а остальное — для животноводства. Производство витамина В₁₂ основано главным образом на культивировании пропионовокислых бактерий (Великобритании, Венгрии), мезофильных и термофильных меганогенных бактерий (Венгрия), а также актиномицетов и родственных форм (Италия).

В СНГ в качестве продуцента витамина В₁₂ используют пропионовокислые бактерии P. shermanii . Для получения витамина B₁₂ бактерии культивируют периодическим методом в анаэробных условиях в среде, содержащей кукурузный экстракт, глюкозу, соли кобальта и сульфат аммония. Образующиеся в процессе брожения кислоты нейтрализуют раствором щелочи, который непрерывно поступает в ферментер. Через 72 ч. в среду вносят предшественник — 5,6-ДМБ. Без искусственного введения 5,6-ДМБ бактерии синтезируют фактор В и псевдовитамин В₁₂ (азотистым основанием служит аденин), не имеющие клинического значения. Ферментацию заканчивают через 72 ч. Витамин B₁₂ сохраняется в клетках бактерий. Поэтому после окончания брожения биомассу сепарируют и экстрагируют из нее витамин водой, подкисленной до рН 4,5 — 5,0 при 85 — 90°С в течение 60 мин. с добавлением в качестве стабилизатора 0,25 % NaNO₂.

Водный раствор витамина В12 охлаждают, доводят рН до 6,8 — 7,0 50 %-ным раствором NaOH. К раствору добавляют Al₂(SO₄)₃* 18Н₂О и безводный FeCl₃ для коагуляции белков и фильтруют через фильтр — пресс. Очистку раствора проводят на ионообменной смоле СГ-1,с которой кобаламины элюируют раствором аммиака. Далее проводят дополнительную очистку водного раствора витамина органическими растворителями, упаривание и очистку на колонке с Аl₂О₃, с окиси алюминия кобаламины элюируют водным ацетоном. К водно-ацетоновому раствору витамина добавляют ацетон и выдерживают 24 — 48 ч. при 3 — 4°С. Выпадающие кристаллы витамина отфильтровывают, промывают сухим ацетоном и серным эфиром и сушат в вакуум-эксикаторе над Р₂О₅. Для предотвращения разложения В₁₂ все операции необходимо проводить в сильно затемненных помещениях или при красном свете. Таким образом можно получить не только смесь CN- и оксикобаламинов, но и коферментную форму, которая обладает высоким терапевтическим эффектом.

Промышленность выпускает различные формы лечебных препаратов кобаламинов: ампулы со стерильным раствором CN – B₁₂, приготовленного на 0,9 % растворе NaCl, таблетки CN — В ₁₂ и в смеси с фолиевой кислотой, таблетки, (муковита), содержащие CN — B ₁₂ и мукопротеид. Лечебные препараты в ампулах: камполон, антианемин и гепавит содержат водный экстракт печени крупного рогатого скота. Перспективны исследования по мутагенезу пропионовокислых бактерий как один из способов повышения продуктивности штамма, а также проверки и внедрения в производственные условия других продуцентов, растущих на дешевом непищевом сырье.

Промышленное получение витамина В12 с помощью пропионовокислых бактерий позволяет полностью удовлетворить потребности медицины. Для обогащения кисломолочных продуктов витамином В12 используют пропионовокислые бактерии как в чистом виде, так и в виде концентрата, приготовленного на молочной сыворотке. Для нужд животноводства витамин В12 получают, используя смешанную культуру, содержащую термофильные метанообразующие бактерии.

Установлено образование корриноидов не только в смешанной, но и в чистой культуре метанобразующих бактерий Methanosarcina barkeri, Methanobacterium formicum при росте в присутствии Н₂ и СО₂. Содержание корриноидов у метанобразующих бактерий составляет 1,0 — 6,5 мг/г сухой биомассы. С помощью смешанной культуры метанобразующих бактерий разработан метод получения кормового препарата витамина В₁₂ — КМБ₁₂. Субстратом для метанового брожения служит ацетоно-бутиловая и спиртовая барда. Ацетоно-бутиловую барду получают в результате удаления растворителей из культуральной жидкости Clostridium acetobutylicum , сбраживающей паточно-мучные заторы. Для метанового брожения используют декантат барды, содержащий 2,0 — 2,5 % сухих веществ. К декантированной барде добавляют 4 г/м 3 СоС1₂ и 0,5 % метанола как стимуляторов синтеза кобаламинов. В качестве биостимуляторов вносят также карбамид и диаммонийфосфат, 5,6-ДМБ не вносят, поскольку CN= B12 и фактор III, обладающие биологической активностью, составляют до 80 % от суммы всех корриноидов.

Исходная барда имеет температуру около 100°С и практически стерильна. Перед поступлением в ферментеры барда охлаждается до 55 — 57°С. В качестве исходной культуры используют смешанную культуру метанообразующих бактерий, осуществляющих термофильное метановое брожение сточных вод. Получение концентрата витамина В12 включает следующие технологические стадии: непрерывное сбраживание барды комплексом бактерий, сгущение метановой бражки и сушку сгущенной массы на распылительной сушилке. Брожение проводят в железобетонных ферментерах непрерывным способом в течение года.

Важное условие нормального процесса брожения — контроль уровня жирных кислот и аммонийного азота. Витамин В₁₂ неустойчив при тепловой обработке, особенно в щелочной среде. Поэтому перед выпариванием к метановой бражке добавляют НСl до оптимального значения рН 5,0 — 5,3 и сульфит (оптимальное содержание 0,07 — 0,1 %). Перед поступлением на установку выпаривания метановая бражка дегазируется путем нагревания до 90 — 95°С при атмосферном давлении. Бражку сгущают до 20% сухих веществ в четырехкорпусных выпарных аппаратах. Сгущенная метановая бражка высушивается на распылительной сушилке.

Сухой концентрат КМБ-12, помимо витамина В12 (100 мг/кг препарата), содержит ряд других ростстимулирующих веществ. Особенно хорошие результаты в животноводстве получают при сочетании витамина В12 с малыми дозами антибиотиков, в частности, с биомицином.

См. также:

Дополнительно:

Технология получения витамина В12

Витамин В12 получают путем микробиологического синтеза из Propionobacterium, а также Pseudomonas и смешанных структурных бактерий.

Основной метод включает использование Propionobacterium. Процесс ведут в реакторе объемом 1 м 3 при коэффициенте заполнения 0,65-0,7.

Технология получения В12 включает две стадии:

1) перемешивание в реакторе в течение 80-88 ч в анаэробных условиях до полной утилизации сахара, после чего полученную массу центрифугируют;

2) процесс обработки суспензии во втором аппарате, уже при доступе воздуха; расход воздуха составляет 2м 3 /ч (рис. 6.10). Для питательной среды используют глюкозу, до 10% солей железа, марганца, магния и кобальта (кон­центрация соли колеблется от 10 до 100 мг/л), сульфат аммония.

Рис.1. Технологическая схема получения витамина В12

Выход кристаллического витамина В12 составляет 40 мг/л.

Разработана также технология получения В12 из термических бацилл. Bacillus Circulans в течение 18 ч при температуре 65-75°C в нейтральных условиях. Выход витамина составляет 2-6 мг/л.

Источник:

Разговоров, П.Б.. Технология получения биологически активных веществ: учеб. пособие / П.Б. Разговоров; Иван. гос. хим.-технол. ун-т. — Иваново,2010. — 72 с.. 2010

При наличии желания более подробно ознакомиться с некоторыми нюансами биосинтеза В12 и его промышленного производства рекомендуем к изучению обзорный материал: Piwowarek K, Lipińska E, Hać-Szymańczuk E, Kieliszek M, Ścibisz I. Propionibacterium spp.-source of propionic acid, vitamin B12, and other metabolites important for the industry . Appl Microbiol Biotechnol. 2018 Jan;102(2):515-538.

Ультразвуковая модуляция метаболической активности Propionibacterium freudenreichii subsp. shermanii при получении пищевых продуктов, обогащённых витамином В12

Витамин В12 – одно из важнейших биологически-активных соединений, участвующих во многих процессах в организме человека. В современных условиях жизни часто наблюдается его дефицит, из-за чего необходимо введение в рацион специальных обогащѐнных продуктов. Однако его синтез очень сложен и в настоящее время он является одним из наиболее дорогостоящих витаминов. Статья посвящена модуляции ультразвуком метаболизма основного промышленного продуцента витамина В12 Propionibacterium shermanii с целью повышения эффективности биотехнологического процесса его производства.

Витамин В12 – группа кобальтсодержащих биологически-активных корриноидных соединений, известных как кобаламины. Он также известен как экзогенный (внешний) фактор Кастла, или животный белковый фактор. Витамин В12 осуществляет биокаталитические реакции, обеспечивающие кроветворную функцию организма. Он также способствует нормализации функции печени, благоприятно влияет на регенерацию нервных волокон и активирует созревание форменных элементов крови [2]. Наиболее важными для производства кобаламинами являются цианокобаламин и оксикобаламин благодаря своей стабильности при хранении и высокой биологической активности. Всасывание витамина происходит в тонком кишечнике после взаимодействия в желудке с гастромукопротеином — «внутренним фактором Кастла», который секретируется клетками слизистой оболочки желудка и обеспечивает его абсорбцию. Основным источником витамина являются пищевые продукты животного происхождения, а также микрофлора желудка и кишечника. В организме человека кишечные бактерии также синтезируют витамин В12, но в обычных условиях осуществляют этот синтез в тех областях, где всасывание витамина в кровь не происходит, так как не происходит связывание витамина с внутренним фактором, поэтому основное его количество должно поступать с пищей [2]. В12-гиповитаминоз может возникать при различных обстоятельствах: длительном вегетарианском питании, беременности, хроническом алкоголизме, а также в связи с различными нарушениями его усвоения при заболеваниях желудочно-кишечного тракта, а относительная алиментарная недостаточность витамина наблюдается практически повсеместно, что может быть исправлено введением в рацион специальных обогащѐнных витамином В12 пищевых продуктов. Однако химический синтез витамина В12 отличается высокой сложностью, и в настоящее время его производят биотехнологическими методами.

Одним из важнейших продуцентов витамина являются пропионовокислые бактерии. Морфологически это неподвижные бесспоровые палочки разной величины, от коккообразных до длинных, располагаются единично, парами или короткими цепочками, способные расти как в анаэробных, так и в аэробных условиях. Они активно сбраживают глюкозу, сахарозу, лактозу и пентозы, благодаря чему способны активно развиваться на различных субстратах, например в молочной сыворотке [6]. В клетках Propionibacterium shermanii корриноиды находятся в 5′-аденозильной форме, в виде которой они проявляют свое биокаталитическое действие и осуществляет метаболические функции и в организме человека, однако для их максимального накопления в культуральной среде необходимо создавать специальные условия культивирования [3].

Одним из способов направленного изменения метаболизма в клетках бактерий является обработка жидких сред ультразвуком, под действием которого ускоряются реакции механохимического происхождения, имевшие место в озвучиваемой среде до воздействия ультразвука и инициируются специфические сонохимические реакции, в основе которых лежит механизм разрыва химических связей и образования свободных радикалов [1].

Таким образом, с помощью ультразвуковой обработки можно проводить направленную модуляцию метаболической активности бактерий для обеспечения увеличения конечного выхода витамина В12 без увеличения длительности производственного процесса [5]. Для определения влияния ультразвука на метаболизм бактерий производилось культивирование клеток штамма Propionibacterium freudenreichii ssp. shermanii I-63, используемого в промышленном производстве витамина В12, в субстрате на основе восстановленной молочной сыворотки с концентрацией лактозы 5%, а также добавками 0,002% CoCl₂·6H₂O и 0,001% MgSO₄. рН в процессе культивирования удерживался на уровне порядка 6,9 с помощью периодической нейтрализации среды.

Во время культивирования раз в сутки производилось кратковременное озвучивание сред ультразвуком низкой интенсивности и различной частоты. Для исследования метаболической активности бактерий в процессе культивирования были выбраны метод определения титруемой кислотности для определения количества синтезируемых бактериями органических кислот, по результатам титрования выяснено, что обработка ультразвуком вызывает повышение титруемой кислотности, причѐм на частоте 20 КГц этот эффект более выражен, чем на 22 КГц при одинаковой интенсивности облучения. Следующим этапом был выбор длительности озвучивания; при этом производилось культивирование пропионовокислых бактерий на аналогичной среде с обработкой субстрата ультразвуком на частоте 20 КГц в течение 10 и 20 минут каждые 24 часа.

Для сравнения различных режимов обработки использовались метод определения титруемой кислотности и спектрофотометрический метод для мониторинга состава сброженной сыворотки [4], а также микроскопический метод для сравнения морфологии клеток.