Двухстадийный ферментативный синтез витамина с

Технология получения витамина С (L-аскорбиновая кислота)

Витамин С, необходимый для нормальной жизнедеятельности человека, впервые выделен из лимона. Он участвует во многих видах окислительно­восстановительных процессов, положительно действует на нервную систему; выступает как мощный противоцинготный препарат.

Рис. 6.11. Строение витамина С

Витамин С синтезируют следующими способами:

— экстракция из растений;

— смешанный ферментативно-химический синтез.

В промышленных масштабах витамин С получают двумя способами:

1) метод Рейхштейна;

2) двухстадийный ферментативный синтез.

Метод Рейхштейна впервые использован в 1933 г. и до сих пор приме­няется компаниями «BASF», «Roshe», «Takeda». Его сущность заключается в двухстадийном превращении L-сорбозы в диацетонкетогулоновую кислоту. Процесс получения аскорбиновой кислоты представлен на рис. 6.12.

Рис. 6.12. Схема процесса получения аскорбиновой кислоты

Рис. 6.13. Схема ферментативного способа (а) и химизм получения L-аскорбиновой кислоты (б)

Технология включает 5 стадий:

1) получение D-сорбита из D-глюкозы методом каталитического восста­новления глюкозы водородом при давлении 8-10 МПа и температуре 135­140°C;

2) получение а-сорбозы из D-сорбита путем биохимического глубинного окисления;

3) получение диацетонсорбозы из сорбозы путем обработки сорбозы аце­тоном в присутствии серной кислоты;

4) окисление диацетонсорбозы в диацетонкетогулоновую кислоту с по­мощью КМпО₄ или других сильных окислителей;

5) образование аскорбиновой кислоты в среде органического раствори­теля (хлороформа или дихлорэтана) в присутствии соляной кислоты, после чего техническую аскорбиновую кислоту перекристаллизовывают в чистый продукт.

Известен способ получения аскорбиновой кислоты с помощью микроор­ганизмов. Питательной средой выступают глюкоза и дрожжи (

200 мг/г биомассы) либо грибы рода Fusarium или рода Aspergillus и бактерии Strepto- cocous thermopiles.

Витамин С выпускают в различных формах — в виде порошков, гранул, аскорбатов натрия и кальция (рис. 6.13, а) [6].

Получение витамина группы D

Под этим термином понимают несколько соединений, относящихся к стеринам; наиболее активными из них являются эргокальциферол (D2) (рис. 6.14) и холкальциферол (D3) [5].

Витамин D регулирует содержание кальция и неорганического фосфора в крови, участвует в минерализации костей. Его хронический дефицит приводит к развитию рахита у детей и разрежению костей у взрослых (остеопороз). Каль­циферолы содержатся в продуктах животного происхождения — рыбьем жире, печени трески, яйцах. При избытке витамина D у детей и взрослых (гипер- витаминоз) развивается интоксикация. Витамин D не разрушается при кулинар­ной обработке, очень чувствителен к свету, действию кислорода.

Витамин D2 получают по технологической схеме, сходной с представ­ленной на рис. 6.5.

Источник

6. Получение субстанции аскорбиновой кислоты является многостадийным процессом, в котором сочетаются методы органического и микробиологического синтеза.

Синтез витамина С осуществляют путем енолизации его важнейшего промежуточного продукта 2-кето-L-гулоновой кислоты, которую, в свою очередь, получают методом 2-х стадийного микробиологического синтеза, состоящего из окисления d-глюкозы в 2,5-дикето-d-глюконовую кислоту (2,5-ДКДГК) и биотрансформации последней в 2-кето-L-гулоновую кислоту (2-КГК).

Значение сокращение числа химических стадий за счет привлечения биотехнологических методов, увеличение выхода конечного продукта реакции, исключаются процессы, связанные с использованием высоких давлений, снижается металлоемкость аппаратуры и резко уменьшает количество вредных выбросов.

Процесс протекает при участии уксуснокислых бактерий.

Ситуационная задача 5

1. В кал поступило несколько серий лекарственного вещества следующей структуры:

Поступил: бензилпенициллина натриевая соль. Порошок во влажной среде гидролизуется до пеницилленовой кислоты, а органические кислоты в воде плохо растворяются.

Для определения качества используют кроме показателя растворимость: прозрачность и цветность раствора, удельное вращение, показатель поглощения, рН, потеря в весе при высушивании.

БЕНЗИЛПЕНИЦИЛЛИН НАТРИЕВАЯ СОЛЬ(Benzylpenicillinum natrium)

Белый мелкокристаллический по­рошок, слегка гигроскопичен. Удельное вращение от +285 до +310° (2%-ный водный раствор). Оень легко растворим в воде, растворим в этиловом и метиловом спирте.

Подлинность подтверждают с помощью УФ- и ИК-спектрофотометрии. Устанавливают значения оптических плотностей растворов солей бензилпенициллина при длинах волн 280 и 263 нм, раз­ность между которыми должна быть не менее 0,72. ИК-спектр идентифицируют по совпадению с полосами поглощения соответствующих стандартных образцов в области 4000-400 см -1 . Подлинность бензилпенициллина натриевой соли устанавливают также методом ТСХ на силикагеле или пластинках Сорбфил с по­следующим проявлением в парах йода.

Важная физическая константа пенициллинов — удельное вращение водных или спиртовых растворов. Все они враща­ют плоскость поляризованного света вправо.

Подлинность

Для испытания подлинности пенициллинов используют цветную реакцию, основанную на разрыве бета-лактамного цикла с образованием внутрикомплексной соли меди (II) с гидроксамовой кислотой (оса­док зеленого цвета) или железа (III) — красное или фиолетовое окрашивание:

Образование этих солей происходит только в определенных интервалах значений рН.

Во всех пенициллинах можно обнаружить органически связанную серу после превращения ее в сульфид-ион сплавле­нием с едкими щелочами. Сульфид-ион затем открывают по образованию красно-фиолетового окрашивания после добав­ления раствора нитропруссида натрия.

За счет иона натрия – пламя желтого цвета.

Соли бензилпенициллина дают положительную реакцию Витали-Морена. При выпаривании их с дымящей азотной кислотой и последующем прибавлении спиртового раствора гидроксида калия и ацетона появляется фиолетовое окрашивание.

Соли бензилпенициллина при ки­пячении в 4%-ном растворе гидроксида натрия гидролизуются с образованием натриевой соли фенилуксусной кислоты, которая после добавления избытка разбавленной серной кислоты обнаруживается по характерному запаху.

Количественное определение пенициллинов выполняют химическими методами. В натриевой соли бензилпенициллина сумму пенициллинов определяют йодометрическим методом. Сущность способа заключается в том, что продукт инактивации пенициллина (1М раствором гидроксида натрия при комнатной температуре) — натриевую соль пенициллоиновой кислоты окисляют йодом. Процесс окисления необходимо проводить при рН 4,5 (ацетатный буфер).

Схема инактивации и окисления на примере бензилпенициллина:

Определение суммы пенициллинов выполняют обратным йодометрическим методом. Избыток 0,01 М раствора йода оттитровывают раствором тиосульфата натрия той же концентрации после 20 мин пребывания ее в темном месте (инди­катор крахмал). Одновременно проводят контрольный опыт с тем же количеством пенициллина, не подвергнутого щелоч­ному гидролизу, а также йодометрическое определение соответствующего ГСО.

Количественное определение натриевой, соли бензилпенициллина выполняют гравимет­рическим методом. Бензилпенициллин извлекают амилацетатом и количественно осаждают в виде N-этилпиперидиновой соли:

Осадок N-этилпиперидиновой соли бензилпенициллина промывают, высушивают до постоянной массы и взвешивают. Затем делают пересчет на соль.

Источник

6.4. Синтез l-аскорбиновой кислоты

В настоящее время для крупномасштабного производства L-аскор­биновой кислоты (витамина С) используют преимущественно трудоем­кий процесс, включающий одну микробиологическую стадию и не­сколько химических. Исходным субстратом для него является D-глюкоза (рис. 16).

На последнем этапе этого процесса 2-кето-L-гулоновая кислота (2-I KLG) превращается в кислых условиях в L-аскорбиновую кислоту.

Биохимические исследования метеболизма различных микроорга­низмов показали, что 2-KLG можно получить, включая совместное культивирование микроорганизмов Corynebacterium и Erwinica herbicola для превращения глюкозы в 2-KLG. Однако условия культивирования, оптимальные для одного организма, неприемлемы для другого, что вле­чет спонтанное «вымывание» из среды одного из них. В подобных слу­чаях можно культивировать микроорганизмы последовательно, но та­кой процесс трудно сделать непрерывным, так как для роста микроор­ганизмов необходимы существенно разные среды (рис. 17).

Наиболее простой способ — создание одного микроорганизма, способного превращать D-глюкозу в 2-KLG, состоит в выделении гена

2,5-DКG-редуктазы Corynebacterium и введении его в Erwinica herbicola (рис. 18).

Трансформированные клетки Erwinica herbicola активно превраща­ют D-глюкозу непосредственно в 2-KLG. При этом собственные фер­менты Erwinica herbicola, локализованные во внутренней мембране бак­териальной клетки, преобразуют глюкозу в 2,5-DKG (2,5-дикетоглюкановая кислота), а 2,5-DКG-редуктаза, локализованная в цитоплазме, катализирует процесс превращения 2,5-DKG в 2-KLG.

Следовательно, с помощью генетических манипуляций удалось в одном организме осуществить метаболические реакции, протекающие в столь разных микроорганизмах. Этот гибрид приобрел способность синтезировать конечный продукт комбинированного метаболического пути. Такой организм используется как фабрика для производства 2-KLG, заменяющая три стадии в том процессе получения L-аскор-биновой кислоты, который доминирует и в настоящее время.

6.5. Гормональные препараты

6.5.1. Инсулин

Инсулин синтезируется (3-клетками островков Лангерганса подже­лудочной железы; 70% мРНК, выделенных из этих клеток, кодируют именно этот белок.

Человеческий инсулин — полипептид с м.м. 5808, состоящий из 51-й аминокислоты, которые образуют две соединенные дисульфидными мостиками полипептидные цепи (одна цепь состоит из 21 аминокисло­ты, так называемая цепь А; другая — из 30 аминокислотных остатков, так называемая цепь В). Аминокислотный состав цепей видоспецифи-чен. Предшественник инсулина продуцируется внутри Р-клеток посред­ством ДНК- и РНК-управляемого синтеза. Длинная цепь проинсулина в аппарате гольджи упаковывается в гранулы, где в результате гидролиза удаляются четыре аминокислоты (обозначенные пунктом на рис. 19) с образованием инсулина и связывающего пигмента, называемого С-пептидом. Инсулин и С-пептид в эквивалентных концентрациях секре-тируются в ответ на все стимуляторы секреции инсулина (глюкозу, маннозу и некоторые аминокислоты — лейцин, аргинин). Выделяется также небольшое количество нативного или частично гидролизованного проинсулина, который оказывает некоторое гипогликемическое дейст­вие. В гранулах р-клеток инсулин депонируется в виде кристаллов, со­стоящих из двух атомов цинка и шести молекул инсулина. В целом, че­ловеческая поджелудочная железа содержит до 8 мг инсулина, что со­ставляет приблизительно 200 биологических «единиц» (количество единиц определяют по массе препарата; существующий инсулиновый стандарт, используемый в аналитических целях, составляет 28 ЕД/мг).

Инсулин обладает мощным действием, охватывающим биосинтез нуклеиновых кислот, белков, обмен углеводов, липидов, продукцию высокоэнергетических соединений. Инсулин регулирует углеводный обмен, усиливает усвоение тканями глюкозы и способствует превраще­нию ее в гликоген, облегчает проникновение глюкозы в клетки тканей. Будучи специфическим средством терапии сахарного диабета, инсулин снижает гепергликемию и глюкозурию, пополняет депо гликогена в мышцах и печени, уменьшает образование глюкозы, снимает диабети­ческую липемию, улучшает общее состояние больного. Единственное отличие больного человека от здорового в том, что здоровые получают

этот гормон благодаря собственной поджелудочной железе, больные — из рук государства.

Сахарным диабетом I типа — инсулинзависимым диабетом (ИЗСД) -официально больны свыше 3 млн российских граждан, «неофициально» — до 10 млн. Известно, что ИЗСД (тяжелая форма, при отсутствии лече­ния приводящая к кетозу), наряду с сердечно-сосудистыми и онкологи­ческими заболеваниями занимает одно из ведущих мест по медико-социальной значимости и является причиной ранней инвалидности и высокой смертности. Диабет II типа — инсулиннезависимый (ИНЗСД) включает более легкие формы диабета. Диабетом этого типа чаще бо­леют тучные люди.

История открытия инсулина связана с именем русского врача И.М. Соболева (вторая половина 19 в.), доказавшего, что уровень саха­ра в крови человека регулируется специальным гормоном поджелудоч­ной железы.

В 1922 г. инсулин, выделенный из поджелудочной железы животно­го, был впервые введён 10-летнему мальчику (Торонто), больному диа­бетом. Результат превзошёл все ожидания, и уже через год американ­ская фирма «Eli Lilly» выпустила первый препарат животного инсулина. Поджелудочная железа крупного рогатого скота (КРС) и свиней постав­ляется бойнями, где опытный персонал по разработанной методике из­влекает железы из туш, их быстро замораживают (оптимальная темпе­ратура — 70 °С) и в вагонах-рефрежераторах направляют на фармацев­тические предприятия, где экстрагируют гормон. Масса поджелудочной железы КРС составляет в среднем 200-250 г, для получения 100 г кри­сталлического инсулина требуется 1000-1200 кг исходного сырья. Бы­чий (говяжий) гормон, в отличие от свиного, обладает несколько боль­шей антигенностью для человека. После получения первой промыш­ленной партии инсулина в последующие несколько лет пройден огром­ный путь его выделения и очистки, в результате гормон стал доступен для лечения больных сахарным диабетом 1 типа. Для адекватного кон­троля уровня глюкозы в крови инсулин нужно было вводить подкожно 4 раза в сутки.

В 1935 г. датский исследователь Хагедорн оптимизировал действие инсулина в организме, предложив пролонгированный препарат — про-тамин-цинк-инсулин (вводили один раз в сутки).

Первые кристаллы инсулина были получены в 1952 г.; развитие ме­тодов очистки гормона (иммуноэлектрофорез, ВЭЖХ) от других гормо­нальных веществ (глюкагона — антагониста инсулина и соматостатина, последний подавляет выделение инсулина и глюкагона) и продуктов деградации инсулина позволили получить гомогенный инсулин, назы­ваемый однокомпонентным.

В 1954 г. английский биохимик Г. Сенджер получил Нобелевскую премию за расшифровку структуры инсулина.

Синтез обеих цепей инсулина и соединение их дисульфидными свя­зями был проведён в 1963-1965 гг. В начале 70-х гг. советскими учёны­ми А. Юдаевым и С. Швачкиным был предложен химический синтез инсулина. Осуществить в промышленном масштабе столь дорогостоя­щий и сложный синтез полипептидного гормона, состоящего из десят­ков аминокислотных остатков, нерентабельно, в том числе и по причине малого выхода.

В 70-е гг. 20 в. шло прогрессирующее улучшение степени очистки инсулинов, что уменьшило проблемы, обусловленные инсулиновой ал­лергией, нарушениями работы почек, расстройством зрения и иммун­ной резистентностью к инсулину. Со времени открытия и до начала 80-х гг. использовали инсулин, получаемый из поджелудочной железы КРС и свиней. Инсулин КРС отличается тремя аминокислотами, свиной — одной аминокислотой от инсулина человека. Наиболее эффективный гормон для заместительной терапии при сахарном диабете — гомоло­гичный инсулин, т.е. инсулин человека.

В 1980 г. датская фармацевтическая компания «Novo» разработала метод превращения инсулина свиньи в инсулин человека ферментатив­ным замещением аланина, последний является 30-й аминокислотой в цепи В, на остаток треонина с последующей хроматографической очи­сткой продукта, в результате был получен однокомпонентный инсулин человека 99% чистоты.

Достижения молекулярной биологии позволили установить, что биосинтез инсулина в р-клетках островковой ткани происходит по сле­дующим основным этапам:

-закодированная информация о структуре гормона содержится в инсулиновом гене (участок ДНК) 11-й хромосомы;

— в результате стимулирующего действия, прежде всего глюкозы и некоторых других веществ, эта информация списывается РНК-полимеразой с инсулинового гена в виде мРНК на рибосо­мах, в которых осуществляется соединение аминокислот с обра­зованием белков. На рибосомах происходит сборка полипеп­тидной цепи из 109 аминокислот с образованием препроинсу-

лина под влиянием рестриктаз, в результате образуются фраг­менты от нескольких сотен до нескольких тысяч нуклеотидов;

-при синтезе препроинсулина в р-клетках поджелудочной желе­зы первые 23 аминокислоты «проводят» молекулу через мем­брану клетки. Эти аминокислоты отщепляются рестриктазами и образуется пептид проинсулин, состоящий из 86 аминокислот. Молекула проинсулина сворачивается таким образом, что на­чальный и конечный её сегменты сближаются, а центральная часть молекулы удаляется под влиянием ферментов рестрикции; роль центральной части сводится к правильному взаимному расположению двух цепей инсулина.

В Великобритании с помощью Е. coli синтезированы обе цепи чело­веческого инсулина, которые затем были соединены в молекулу биоло­гически активного гормона. Чтобы одноклеточный организм мог синте­зировать на своих рибосомах молекулы инсулина, необходимо снабдить его нужной программой, т.е. ввести ему ген гормона. Химическим спо­собом (операцию проводят специалисты биохимики) получают ген, программирующий биосинтез предшественника инсулина или два гена, программирующие в отдельности биосинтез цепей А и В инсулина. Следующий этап — включение гена предшественника инсулина (или гены цепей инсулина порознь) в геном Е. coli — особого штамма кишеч­ной палочки, выращенного в лабораторных условиях; эту задачу вы­полняет генная инженерия. Из Е. coli вычленяют плазмиду соответст­вующей рестриктазой. Синтетический ген встраивается в плазмиду (клонированием с функционально активной С-концевой частью (B-галактозидазы Е. coli). В результате Е. coli приобретает способность синтезировать белковую цепь, состоящую из галактозидазы и инсулина. Синтезированные полипептиды отщепляют от фермента химическим путём, затем проводят их очистку. В бактериях синтезируется около 100000 молекул инсулина на бактериальную клетку.

Природа гормонального вещества, продуцируемого Е. coli, обуслов­лена тем, какой ген встраивается в геном одноклеточного организма. Если клонирован ген предшественника инсулина, бактерия синтезирует предшественник инсулина, который подвергается затем обработке рест­риктазами для отщепления препептида с вычленением С-пептида, вследствие чего получается биологически активный инсулин. Для полу­чения очищенного инсулина человека выделенный из биомассы гиб­ридный белок подвергают химико-ферментативной трансформации и

соответствующей хроматографической очистке (фронтальной, гель-проникающей, анионообменной).

В Институте биоорганической химии РАН получен рекомбинант-ный инсулин с использованием генно-инженерных штаммов Е. coli. Из ■ выращенной биомассы выделяется предшественник, гибридный белок, экспрессируемый в количестве 40% от всего клеточного белка, содер­жащий препроинсулин. Превращение его в инсулин in vitro осуществ­ляется в той же последовательности, что и in vivo — отщепляется лиди­рующий полипептид, препроинсулин превращается в инсулин через стадии окислительного сульфитолиза с последующим восстановитель­ным замыканием трёх дисульфидных связей и ферментативным вычле­нением связывающего С-пептида. После ряда хроматографических очи­сток, включающих ионообменные, гелевые и ВЭЖХ, получают челове­ческий инсулин высокой чистоты и природной активности.

Использование аффинной хроматографии значительно снизило со­держание в препарате загрязняющих белков с более высокой м.м., чем у инсулина. К таким белкам относятся проинсулин и частично расщеп­ленные проинсулины, которые способны индуцировать выработку ан-тиинсулиновых антител. Стандартизация инсулина по загрязнению классифицирует препараты на обычные, содержащие проинсулина бо­лее 1%, монопиковые — менее 0,3% п, улучшенные монопиковые — ме­нее 0,005% и монокомпонентные, содержащие менее 0,001% проинсу­лина.

Использование человеческого инсулина с самого начала терапии сводит к минимуму возникновение аллергических реакций. Наиболее частые осложнения инсулиновой терапии — гипогликемические состоя­ния, основными признаками избытка инсулина являются нарушения функции ЦНС (спутанность сознания, странное поведение, кома).

Компания «Eli Lilly» в массовом производстве человеческого инсу­лина использует технологию рекомбинантных ДНК, помещая кДНК гена человеческого проинсулина в Е. coli или S. serevisae и гидролизуя наработанный проинсулин до молекулы инсулина. Человеческие инсу-лины этой фирмы носят название «Хумулин». В медицинской практике используют рекомбинатные человеческие инсулины из серии Хумулин («Eli Lilly») — регулярный, НПХ, ленте, ультраленте и их комбиниро­ванные составы. Человеческий инсулин быстрее абсорбируется и неза­висимо от формы препарата имеет более короткую длительность дейст­вия, чем животные инсулины. Человеческие инсулины менее иммуно-генны, чем свиные, особенно смешанные бычьи и свиные инсулины.

В молекуле инсулина обнаружены области, играющие повышенную роль в его физико-химических и биологических свойствах. При внесе­нии мутационных изменений в аминокислотную последовательность этих областей, существенным образом изменяются свойства молекулы з целом. Удалось получить аналоги с модификацией В-цепи, что привело к значительному увеличению гормональной активности по сравнению с природным инсулином.

Контроль качества генноинженерного инсулина предполагает кон­троль дополнительных показателей, характеризующих стабильность рекомбинантного штамма и плазмиды, отсутствие постороннего гене­тического материала в препарате, идентичность экспрессируемого гена и др. (всего 22 показателя).

В настоящее время в медицинской практике используют инсулины трех типов:

короткодействующие с быстрым началом эффекта;

средней продолжительности действия;

длительного действия с медленным проявлением эффекта.

Инсулин короткого действия — регулярный инсулин — представляет собой короткодействующий растворимый при нейтральном значении рН кристаллический цинк-инсулин, эффект которого развивается в те­чение 15 мин после подкожного введения и продолжается 5-7 ч.

С целью увеличения длительности действия все другие препараты инсулина модифицированы и при растворении в нейтральной среде об­разуют суспензию. Они содержат протамин в фосфатном буфере — про-тамин-цинк-инсулин и НПХ (нейтральный протамин Хагедорна) — НПХ-инсулин или различные концентрации цинка в ацетатном буфере —инсулины ультраленте, ленте, семиленте.

Препараты инсулина средней длительности действия содержат про­тамин, представляющий белок средней м.м. 4400, богатый аргинином и получаемый из молок радужной форели. Для образования комплекса требуется соотношение протамина и инсулина 1:10. После подкожного введения протеолитические ферменты разрушают протамин, позволяя инсулину всасываться.

НПХ-инсулин не изменяет фармакокинетический профиль смеши­ваемого с ним регулярного инсулина. НПХ-инсулин предпочтительнее инсулина ленте в качестве компонента средней длительности действия в терапевтических смесях, содержащих регулярный инсулин.

В фосфатном буфере все инсулины (свиной, бычий, человеческий) легко образуют кристаллы с цинком, но только кристаллы бычьего инсулина обладают достаточной гидрофобностью, чтобы обеспечить за­медленное и стабильное высвобождение инсулина, характерного для ультраленте. Цинковые кристаллы свиного инсулина растворяются бы­стрее, эффект наступает раньше, длительность действия короче. Поэто­му не существует препарата ультраленте, содержащего только свиной инсулин. Монокомпонентный свиной инсулин выпускают под названи­ем инсулин-суспензия, инсулан-нейтрал, инсулин-изофан, инсулин-аминохинурид.

Инсулин ленте — это смесь 30% инсулина семиленте (аморфный преципитат инсулина с ионами цинка в ацетатном буфере, эффект кото­рого развеивается относительно быстро) с 70% инсулина ультраленте (плохо растворимый кристаллический цинк-инсулин, имеющий замед­ленное начало и пролонгированное действие). Эти два компонента обеспечивают комбинацию с относительно быстрой абсорбцией и ста­бильным длительным действием, делая инсулин-ленте удобным тера­певтическим средством.

При введении инсулина в виде аэрозоля на слизистую оболочку но­са эффективный уровень препарата в плазме достигается быстро, одна­ко, длительное интраназальное введение инсулина оказывает токсиче­ское действие на слизистую оболочку.

Источник