36. Стерилизация и дезинфекция. Методы стерилизации питательных сред и лабораторной посуды.
Стерилизация — обработка объектов, при которой достигается полное уничтожение всех микроорганизмов. В результате стерилизации объект становится свободным как от патогенных, так и от сапрофитных микробов. Существуют различные методы и способы стерилизации, в основе которых лежит действие физических или химических факторов. Критерием гибели микроорганизмов является необратимая утрата способности к размножению, что можно оценить путем количественного подсчета числа колоний после высева смывов на чашки с питательными средами.
Наиболее широко применяют методы тепловой стерилизации: кипячением, сухим жаром в атмосфере горячего воздуха или влажным жаром при помощи пара, а также прокаливанием предметов в огне.
Прокаливание на огне — надежный метод стерилизации бактериологических петель, металлических и стеклянных предметов. Однако применяется ограниченно ввиду их порчи.
Стерилизация сухим жаром или горячим воздухом производится в сушильных шкафах или печах Пастера при температуре 160—170°С в течение 1—1,5 ч по достижении заданной температуры. Этим методом стерилизуют лабораторную посуду, инструменты, минеральные масла , вазелин. Жидкости и резину сухим жаром стерилизовать нельзя. Предметы, подлежащие стерилизации, заворачивают в бумагу или закладывают в металлические пеналы для предохранения от последующего загрязнения. Необходимо помнить, что при темпера-, туре выше 170°С начинается обугливание бумаги, ваты, марли, а при более низкой температуре не происходит гибели спор.
Стерилизация кипячением в течение 30 мин убивает вегетативные формы микробов. Споры многих бактерий при этом сохраняются, выдерживая кипячение в течение нескольких часов. Для уничтожения вирусов — возбудителей болезни Боткина необходимо кипячение в течение 45—60 мин. Кипячению в специальных стерилизаторах подвергают шприцы, хирургические инструменты, иглы, резиновые трубки. Для повышения точки кипения и устранения жесткости воды добавляют 2% гидрокарбоната натрия.
Стерилизация насыщенным паром под давлением (автоклавирование) является наиболее надежным и быстрым методом стерилизации. Обеспложивание достигается воздействием пара, температура которого под давлением выше, чем температура кипящей воды: при давлении 0,5 атм 112°С, при 1 атм. 121 °С , при 1,5 атм 127°С и при 2 атм 134°С.
Стерилизация текучим паром проводится в аппарате Коха или в автоклаве при не завинченной крышке и открытом выпускном кране. На дно аппарата Коха наливают воду и нагревают до 100°С. Образующийся пар движется вверх через заложенный материал и стерилизует его. Так как однократное действие паров воды не убивает споры, применяют дробную стерилизацию — 3 дня подряд по 30 мин. Споры, не погибшие при первом прогревании, прорастают до следующего дня в вегетативные формы и погибают при втором и третьем прогревания.
Тиндализация – дробная стерилизация, которая проводится при температуре ниже 100 оС. Тиндализацию проводят на водяной бане по часу при температуре 60 – 65 оС в течение пяти дней или при 70 – 80 С три дня. Используют для обеззараживания питательных сред, содержащих белок, кровяную сыворотку, витамины, ферменты.
Дезинфекция — уничтожение патогенных микробов в окружающей человека среде. Методы и способы дезинфекции. различны, но они преследуют цели уничтожения не всех микроорганизмов, а только патогенных. Уничтожение возбудителей инфекционных заболеваний в переносчиках называют дезинсекцией, а в организме грызунов — источников инфекции — дератизацией.
При выполнении различных видов дезинфекции применяют механические, физические и химические способы и средства. К первым относятся мытье рук с мылом и щеткой, влажная уборка помещений, стирка белья, проветривание помещений и др., преследующие цель удаления микроорганизмов с объекта. Физические способы: кипячение, сжигание, обработка паром (текучим и под давлением) с использованием автоклава и дезинфекционных камер, приводят к уничтожению патогенных микробов. Применение химических дезинфицирующих средств целесообразно сочетать с механическими способами и действием физических факторов.
Стерилизацию питательных сред осуществляют различными способами в зависимости от тех ингредиентов, которые входят в их состав.
Синтетические среды и все агаровые среды, не содержащие в своем составе нативного белка и углеводов, стерилизуют 15-20 мин в автоклаве при температуре 115-120°С.
Среды с углеводами и молоком, питательный желатин стерилизуют текучим паром при температуре 100°С дробно или в автоклаве при 112°С.
Среды, в состав которых входят белковые вещества (сыворотка крови, асцитическая жидкость), обеспложиваются тиндализацией или фильтрованием.
Для стерилизации питательных сред, содержащих в своем составе нативные белки, пользуются фильтрацией через мембранные фильтры Зейтца.
Лабораторную посуду стерилизуют:
а) сухим жаром при температуре 150, 160 и 180?С соответственно 2 часа, 1 час и 30 минут.
б) в автоклаве при давлении 1 атм. В течение 20-30 минут
37. Материальные основы наследственности микроорганизмов. Генотип и фенотип. Формы изменчивости. Факторы, вызывающие изменчивость микроорганизмов. Внутривидовая ненаследственная изменчивость. Реверсия.
Материальной основой наследственности, определяющей генетические свойства всех организмов, в том числе бактерии и вирусы, является молекула ДНК. Исключение составляют только РНК-содержащие вирусы, у которых генетическая информация закодирована в РНК.
У бактерий обычно имеется одна замкнутая хромосома, содержащая до 4000 отдельных генов, необходимых для поддержания жизнедеятельности и размножения бактерий, то есть бактериальная клетка гаплоидна.
Внехромосомные факторы наследственности
Внехромосомные факторы наследственности бактерий представлены плазмидами, вставочными последовательностями и транспозонами.
Плазмиды — фрагменты ДНК (от 40 до 50 генов). Выделяют автономные (не связанные с хромосомой бактерии) и интегрированные (встроенные в хромосому) плазмиды.
Выделяют следующие группы плазмид.
F-плазмиды. F-плазмиды контролируют синтез F-пилей, способствующих спариванию бактерий-доноров (F+) c бактериями-реципиентами (F-).
R-плазмиды (от англ. resistance, устойчивость) кодируют устойчивость к лекарственным препаратам.
Плазмиды патогенности контролируют вирулентные свойства бактерий и токсинообразование (плазмиды включают tox+-гены).
Плазмиды бактериоциногении кодируют синтез бактериоцинов — белковых продуктов, вызывающих гибель бактерий того же или близких видов.
Свойства микроорганизмов, как и любых других организмов, определяются их генотипом, т.е. совокупностью генов данной особи. Термин «геном» в отношении микроорганизмов — почти синоним понятия «генотип».
Фенотип представляет собой результат взаимодействия между генотипом и окружающей средой, т. е. проявление генотипа в конкретных условиях обитания. Фенотип микроорганизмов хотя и зависит от окружающей среды, но контролируется генотипом, так как характер и степень возможных для данной клетки стенотипических изменений определяются набором генов, каждый из которых представлен определенным участком молекулы ДНК.
В основе изменчивости лежит либо изменение реакции генотипа на факторы окружающей среды, либо изменение самого генотипа в результате мутации генов или их рекомбинации. В связи с этим фенотипическую изменчивость подразделяют на наследственную и ненаследственную.
Любая наблюдаемая изменчивость является фенотипической. В свою очередь, фенотипическая, или общая изменчивость включает три компонента:
Наследственная (генетическая, или генотипическая изменчивость) – в значительной мере обусловлена влиянием генетических факторов. Например, в сходных условиях выращивается несколько сортов одного вида растений. Тогда различия между результатами эксперимента (например, урожайность) обусловлены генетическими особенностями каждого сорта. В основе генетической изменчивости лежит мутационная и комбинативная изменчивость.
Ненаследственная (модификационная) изменчивость – в значительной мере обусловлена действием негенетических (экзогенных) факторов. Например, один сорт растений выращивается в разных условиях. Тогда различия между результатами эксперимента (например, урожайность) обусловлены влиянием условий выращивания растений.
Неконтролируемая (остаточная изменчивость) – обусловлена неконтролируемыми (по крайней мере, в данном эксперименте) факторами.
Факторы, вызывающие эту изменчивость, разнообразны. К ним относятся состав питательной среды, рН окружающей среды, концентрация минеральных солей, температура, ультрафиолетовые лучи, действие фагов, лекарственных и дезинфицирующих препаратов, различные химические соединения, ультразвук, ионизирующая радиация и многое другое.
Реверсия (reversion) [лат. reversio — возврат] — восстановление у мутантного организма дикого фенотипа в результате новой мутации.
Источник
Стерилизация лучистой энергией и ультразвуком.
Стерилизация лучистой энергией.
Для стерилизации используются УФ-лучи и -лучи.
Уф-излучение используют для стерилизации воздуха лечебных и детских учреждений, аптек, бактериологических боксов, лабораторий и цехов заводов, продуктов питания, питательных сред, посуды. В последнее время этот метод входит в практику обработки вакцин и сывороток. Этот метод не изменяет качества продуктов, так как в малых дозах УФ-лучи не нарушают целостность макромолекул белков, витаминов, ферментов, полисахаридов.
Для стерилизации воздуха используют бактерицидные лампы: БУВ-15, БУВ-30. При стерилизации прозрачных растворов термолабильных веществ (белков, витаминов, антибиотиков) их наливают в сосуды из кварцевого стекла тонким слоем и периодически встряхивают, так как УФ-лучи обладают слабой проникающей способностью.
-лучи используют для стерилизации объектов, которые не выдерживают термических и химических методов. Они не изменяют качества продукта, не вызывают денатурации. Этим способом стерилизуют: одноразовую пластиковую посуду, питательные среды, перевязочный материал, некоторые лекарственные препараты ( антибиотики, гормоны), системы для переливания крови, одноразовые шприцы.
В качестве источника -лучей используют Со 60 . Этот вид стерилизации включается в непрерывный производственный процесс. После стерилизации необходимо проводить контроль остаточной радиации.
Ультразвук используют для стерилизации пищевых продуктов (их питательная ценность при этом сохраняется максимально), вакцин, некоторых объектов лабораторного оборудования, которые портятся при действии повышенной температуры и химической стерилизации. Для стерилизации ультразвуком используются специальные ультразвуковые датчики.
Стерилизация фильтрованием.
Фильтрование относится к механическим факторам, влияющим на микроорганизмы. Для этого используются бактериальные фильтры. Бактериальные фильтры задерживают микроорганизмы и их споры, так как размеры пор на фильтрах меньше, чем размеры микроорганизмов. Фильтрование используют для стерилизации жидких материалов, не выдерживающих нагревание. Фильтрование можно также использовать для получения токсинов, фагов и других продуктов жизнедеятельности микроорганизмов.
Аппаратура: асбестовые и мембранные фильтры, воронки Зейтца, специальные колбы, вакуумный насос. Мембранный фильтр стерилизуют кипячением, вставляют в стерильную воронку Зейтца, а воронку – в колбу, присоединенную к вакуумному насосу. Фильтрование производят при помощи насоса. Систему с асбестовым фильтром предварительно стерилизуют в автоклаве.
Стерилизуемый материал: сыворотка крови, антибиотики, растворы гормонов, витаминов, ферментов.
Недостаток этого метода в том, что он не освобождает стерилизуемый материал от вирусов.
Химическая стерилизация.
Газовая стерилизация — стерилизация с использованием стерилизующих газов — формальдегида, окиси этилена, бромид метила, надуксусной кислоты. Чаще используют окись этилена или ее смесь с бромидом метила.
Аппаратура — герметические контейнеры, в которые запускают стерилизующие газы. После стерилизации газ удаляют продуванием стерильного воздуха. Обязательно проводится контроль на остаточную концентрацию газов в материале, так как они токсичны.
Стерилизуемый материал: крупногабаритные изделия, приборы (например, для космических кораблей), аппараты искусственного кровообращения, катетеры, зонды, хирургические перчатки, упакованные в бумагу.
Химические вещества можно использовать для стерилизации воздуха и различных поверхностей. Для этого используют 3% раствор перекиси водорода при ежедневной уборке производственных помещений и 6% раствор – при генеральной уборке. Для стерилизации воздуха в боксах и операционных используют раствор 3% перекись водорода и 0,5% раствор молочной кислоты или 3-6%раствор перекиси водорода и 0,5% раствор сульфонола. Эти растворы распыляют за 40-50 мин до работы. В результате обсемененность воздуха снижается в 30-40 раз.
Источник
7.2. Химические методы
Применение этих методов сводится к профилактике микробного загрязнения питательных сред, вакцин, диагностических и лечебных сывороток путем включения в их состав различных химических консервантов.
Питательные среды можно консервировать хлороформом, толуолом, эфиром. До посева такие среды прогревают при 56° для освобождения от этих веществ.
В биопромышленности вакцины и лечебные сыворотки консервируют карболовой кислотой, доводя концентрацию до 0,25-0,5%, формалином — до 0,05%, мертиолятом – до 1:5000 – 1:10000.
Сыворотки консервируют борной кислотой, толуолом или глицерином.
Различные химические вещества в лабораторной практике получили широкое использование для дезинфекции. С этой целью применяют растворы карболовой кислоты (3-5%-ные), хлорамина (1-3%-ные), этиловый спирт (70°) и др.
К химическим методам относится и стерилизация газами. Стерилизующими газами являются: формальдегид, окись этилена и пропиолактон.
Преимущество газов как стерилизующих веществ состоит в том, что их применение не требует нагревания; кроме того, их можно применять для стерилизации больших объемов, например помещений. Однако при их использовании нужно соблюдать большую осторожность, так как они оказывают токсическое действие на животных и людей.
7.3. Механические методы
Они основаны на фильтрации жидкостей через мелкопористые бактериальные фильтры, которые задерживают видимые под микроскопом микроорганизмы. Через них свободно проходят вирусы и микоплазмы, поэтому данные методы следует признать как «частичную» стерилизацию.
Фильтрование – один из очень удобных методов стерилизации тех жидкостей, которые нельзя простерилизовать другими способами, например, сыворотку крови, питательные среды и др.
Наиболее широко в микробиологической практике используют фильтры-свечи и пластинчатые фильтры.
Фильтры-свечи (рис. 20) имеют форму цилиндра с толстыми стенками и с полостью внутри. Одна группа свеч (Беркефельда) изготавливается из инфузорной земли. По величине пор в порядке уменьшения они обозначаются буквами W, N, V.
Рис. 20. Смонтированные свечи: фильтруемую жидкость наливают внутрь свечи (А), свеча погружается в фильтруемую жидкость (Б)
Другая группа свечей (Шамберлана) изготавливается из каолина с примесью песка и кварца. Они имеют различные размеры пор, условно обозначаемые L1, L2, L3, и т.д.
Фильтрация жидкостей через свечи может производиться двояко: под повышенным или пониженным давлением. В первом случае через свечу пропускают фильтруемую жидкость под давлением. Для этого жидкость наливают в сосуд, к которому присоединяют свечу. Нагнетательным насосом накачивают в этот сосуд воздух, который давит на жидкость; последняя поступает в полость свечи и просачивается через поры. Просочившаяся жидкость поступает в другой сосуд, в который вставлена свеча, а из него в присоединенную резиновой трубкой колбу. Давление, создающееся накачиванием воздуха, определяется манометром.
Во втором случае фильтрация производится с помощью уменьшения (создания вакуума) в сосуде, куда должна поступить профильтрованная жидкость. Свечу помещают в сосуд с фильтруемой жидкостью и соединяют трубкой с другим сосудом, из которого откачивается воздух. В результате откачивания воздуха создается значительное разрежение как в пустом сосуде, так и в полости соединенной с ним свечи. Жидкость из сосуда, в который помещена свеча, в силу разности давления устремляется в полость свечи (проходит через поры) и поступает в сосуд.
Перед фильтрацией обязательно должны быть простерилизованы свечи, трубки, соединяющие их с сосудами, и сами сосуды.
Отечественные асбестовые фильтры выпускаются с обозначениями Ф2 и СФ, последние являются стерилизующими мембранными фильтрами. Особенно широкое применение нашли так называемые мембранные фильтры, которые изготавливают из асбеста, бумаги, коллодия, ацетата целлюлозы. Обычно эти фильтры представляют собой диски различного диаметра. Такие диски пронизаны бесчисленным множеством мельчайших цилиндрических отверстий. В зависимости от способа изготовления фильтров диаметр этих отверстий может быть от 1 мкм до менее 0,005 мкм.
Мембранные фильтры монтируют в приборе Зейтца, который состоит из стакана (воронки) и колбы Бунзена, на тубус этой колбы надевают резиновый вакуумный шланг с ватным фильтром (рис. 21).
Собранный прибор завертывается в бумагу и стерилизуется ав-гоклавированием.
Жидкость, подлежащую стерилизации, наливают в воронку прибора, внутри которого создается вакуум и жидкость фильтруется, освобождаясь от бактерий.
Перед стерилизацией лабораторную посуду моют и сушат. Пробирки, флаконы, бутылки, колбы закрывают ватно-марлевыми пробками. Поверх пробирки на каждый сосуд надевают бумажный колпачок. Чашки стерилизуют завернутыми в бумагу по 2-4 штуки.
Для стерилизации пипеток в верхнюю часть каждой из них вкладывают кусочек ваты и затем заворачивают пипетки в плотную бумагу, нарезанную предварительно полосками шириной 2-2,5 см и длиной 50-70 см. На бумаге пишут объем завернутой пипетки. Пипетки можно стерилизовать также в специальных пеналах.
Рис. 21. Фильтр Зейтца с приемником
Мелкие металлические инструменты (петли, иглы, пинцеты, ножницы) стерилизуют прокаливанием в пламени непосредственно перед использованием. Изделия из резины (резиновые пробки, перчатки, шланги) стерилизуют автоклавированием. Предметы, изготовленные из термолабильных материалов: пластмасс, например, центрифужные пробирки, стерилизуют УФ-лучами, окисью этилена.
Задания для самостоятельной работы
1. Ознакомиться с устройством приборов и аппаратов для стерилизации.
2. Освоить технику работы с автоклавом, текучепаровым аппаратом, фильтровальными приборами.
3. Освоить технику подготовки чашек Петри, пипеток, другой посуды и простерилизовать в сушильном шкафу.
Вопросы для самоподготовки и контроля знаний
1. Стерилизацией называется:
А. Уничтожение патогенных микробов в объектах или окружающей среде.
Б. Комплекс мероприятий, направленных на предупреждение попадания микробов на (в) какой-либо объект.
В. Полное уничтожение в объекте всех жизнеспособных микробов и их спор.
2. К физическим методам стерилизации относят:
Б. Газовую стерилизацию.
В. Высокую температуру.
Г. Фильтрование через бактериальные фильтры.
Д. Ультрафиолетовые лучи.
3. В автоклаве при 1,0 атм (120°) в течение 15 мин стерилизуют:
А. Простые питательные среды (МПА и МПБ).
Б. Сывороточные среды.
В. Физиологический раствор.
Г. Среды с углеводами.
Д. Отработанный материал (культуры микробов, трупы лабораторных животных и т.д.)
4. В сушильных шкафах сухим жаром стерилизуют:
А. Стеклянную посуду.
Б. Простые питательные среды (МПА и МПБ).
Г. Термостойкие порошкообразные лекарственные вещества.
5. Споры бацилл погибают при:
В. Стерилизации сухим жаром.
Г. Длительном высушивании.
6. Каким из перечисленных методов стерилизации воспользовались, если применили следующий режим работы: дробная стерилизация при температуре 56-58° в течение 5-6 дней?
7. Каким из перечисленных методов стерилизации воспользовались, если применили следующий режим работы: при 1 атм — 120° в течение 20 мин?
Г. Дробная стерилизация текучим паром.
8. Какой из методов наиболее приемлем для уничтожения бактериальных культур?
В. Фильтрование через бактериальные фильтры.
9. Каким из перечисленных методов стерилизации воспользовались, если применили следующий режим работы: при температуре 100° в течение трех дней подряд по 30 мин в день?
Г. Дробная стерилизация текучим паром.
10. Назовите режим работы, применяемый для пастеризации:
11. Назовите нормальный режим работы автоклава при стерилизации инфицированного материала:
А. 80° при давлении в 1,0 атм.
Б. 56° при давлении в 0,5 атм.
В. 126° при давлении 1,5 атм.
Г. 126° при давлении 2,0 атм.
12. Какой из перечисленных методов нужно применить для стерилизации питательных сред с углеводами:
А. Дробная стерилизация текучим паром.
13. Каким методом можно пастеризовать сыворотку крови:
Б. Методом тиндализации.
Г. Фильтрацией через бактериальные фильтры.
14. Дезинфицирующими веществами являются:
Источник