ДЕГИДРОГЕНА́ЗЫ
В книжной версии
Том 8. Москва, 2007, стр. 417
Скопировать библиографическую ссылку:
ДЕГИДРОГЕНА́ЗЫ, ферменты класса оксидоредуктаз, катализирующие реакции дегидрирования – отщепления атомов водорода от субстрата-донора и переноса их на акцепторы, в качестве которых обычно выступают коферменты Д. – никотинамидадениндинуклеотид (НАД), никотинамидадениндинуклеотидфосфат (НАДФ), флавинадениндинуклеотид (ФАД) и флавинмононуклеотид (ФМН). У некоторых Д. растений, животных и микроорганизмов акцепторами водорода служат также цитохром с , ферредоксин и др. Во всех типах клеток Д. участвуют в окислит.-восстановит. реакциях, связанных с метаболич. превращениями разл. веществ. При этом одни восстановленные акцепторы (в т. ч. НАДН, ФАДН 2) используются клетками преим. для производства энергии, другие (напр., НАДФН) – в восстановит. синтетич. процессах. К числу наиболее изученных Д. относится алкогольдегидрогеназа . Некоторые Д. нашли применение в качестве биосенсоров (напр., глюкозодегидрогеназа термофильных бактерий – для определения глюкозы крови). Ряд Д. используются в диагностике разл. заболеваний человека (напр., при инфаркте миокарда в сыворотке крови повышается содержание некоторых изоформ лактатдегидрогеназы).
Источник
ДЫХАТЕЛЬНЫЕ ФЕРМЕНТЫ
ДЫХАТЕЛЬНЫЕ ФЕРМЕНТЫ — ферменты, участвующие в переносе электронов от органических субстратов к кислороду; являются важнейшим звеном процесса преобразования энергии в биологических системах; величина активности некоторых из этих ферментов в сыворотке крови служит дополнительным диагностическим тестом при ряде заболеваний. Д. ф. являются одними из главных дыхательных пигментов (см.).
В зависимости от хим. природы кофакторов Д. ф. или их простетических групп Д. ф. подразделяются на три основных класса: 1) пиридинзависимые дегидрогеназы (см.), коферментами которых являются НАД или НАДФ (см. Коферменты); 2) флавиновые дегидрогеназы, содержащие в качестве простетических групп флавинмононуклеотид (ФМН) или ФАД (см. Флавопротеиды); 3) Цитохромы (см.), простетическими группами которых являются железопорфирины.
Эти Д. ф. составляют сложную многокомпонентную мембранную систему, называемую дыхательной цепью.
К числу пиридин-зависимых дегидрогеназ относится св. 150 ферментов, которые катализируют восстановление НАД и НАДФ различными органическими субстратами (см. Окисление биологическое). При этом происходит перенос одного атома водорода в виде гидридного иона (H — ) в положение 4 порфиринового кольца пиридиннуклеотидов. Другой атом водорода отщепляется от молекулы субстрата в виде протона (H+). При ферментативном восстановлении пиридиннуклеотидов, в отличие от обычного хим. восстановления, присоединение атома водорода происходит стереоспецифически, т. е. с одной определенной стороны пиридинового кольца. Окисленные пиридиннуклеотиды имеют в спектре интенсивную полосу поглощения при 260 нм. При их восстановлении появляется максимум поглощения при 340 нм и снижается интенсивность полосы при 260 нм. Это свойство НАД(Ф)-зависимых дегидрогеназ лежит в основе многих методов количественного определения их активности (см. Дегидрогеназы).
НАД-зависимые дегидрогеназы участвуют преимущественно в процессах дыхания, связанных с переносом электронов от органических субстратов к кислороду и аккумуляцией энергии, а НАДФ-зависимые дегидрогеназы играют существенную роль в восстановительных реакциях биосинтеза. В соответствии с этим НАД и НАДФ различаются по своей внутриклеточной локализации: НАД концентрируется гл. обр. в митохондриях, а большая часть НАДФ находится вне митохондрий. Пиридин-зависимые дегидрогеназы, как правило, слабо связаны с мембранами и легко солюбилизируются (см. Солюбилизация).
Флавиновые дегидрогеназы (их насчитывается ок. 30) осуществляют перенос электронов от восстановленных НАД, НАДФ и некоторых других органических субстратов на цитохромную систему. Этот перенос обычно осуществляется промежуточными переносчиками, способными служить акцепторами для флавопротеидов, напр, убихиноном. Восстановленные флавопротеиды (см.) легко окисляются также рядом искусственных электронных акцепторов (феррицианид, феназинметосульфат и др.). Некоторые флавиновые ферменты (альдегидоксидаза, ксантиноксидаза) могут непосредственно восстанавливать молекулярный кислород с образованием H2O2. Благодаря ФМН и ФАД, имеющим в окисленном состоянии полосу поглощения при 450 нм, флавопротеиды окрашены в желтый цвет, поэтому они были названы О. Варбургом, желтыми ферментами.
Активной частью флавиннуклеотидов является изоаллоксазиновое кольцо рибофлавина, к атомам азота к-рого могут присоединиться два атома водорода при соответствующей перегруппировке двойных связей. При восстановлении флавиннуклеотидов в их спектре исчезает полоса поглощения при 450 нм. Флавопротеиды обычно акцептируют пару электронов от окисляемого субстрата не одновременно, а в две стадии с образованием промежуточных полувосстановленных свободнорадикальных форм (флавосемихиноны), которые могут быть обнаружены методом ЭПР — электронного парамагнитного резонанса (см.). При взаимодействии с двухэлектронными акцепторами (хинонами) флавиновые Д. ф. могут восстанавливать их по одноэлектронному (НАД•H-дегидрогеназа; КФ 1.6.99.3) либо двухэлектронному (митохондриальная НАДФ•H-дегидрогеназа; КФ 1.6.99.2) механизму Ямадзаки (J. Yamazaki). Ксантиноксидаза (КФ 1.2.3.2) может катализировать как одно-, так и двухэлектронное восстановление.
Многие из флавиновых Д. ф. являются сложными олигомерными образованиями, которые состоят из нескольких белковых субъединиц и содержат, помимо флавиннуклеотидов, также атомы металлов (негеминовое железо, молибден), участвующих наряду с ФМН и ФАД в переносе электронов через флавопротеиды. Некоторые флавиновые Д. ф., напр. НАД•H- и сукцинатдегидрогеназы митохондрий, НАДФ•H-дегидрогеназа микросом, прочно связаны с мембранами. В области НАД•H-дегидрогеназнго участка дыхательной цепи митохондрий локализован один из пунктов сопряжения между дыханием и фосфорилированием (см.).
Перенос электронов от флавопротеидов к молекулярному кислороду осуществляется с помощью системы цитохромов — гемсодержащих белков с характерными спектрами поглощения в окисленном и восстановленном состояниях. Цитохромоксидаза (КФ 1.9.3.1; цитохром а+a3) в митохондриях и цитохром Р-450 в эндоплазматических мембранах (микросомах) являются терминальными Д. ф., непосредственно взаимодействующими с кислородом. Цитохромы b, c1 и с в митохондриях и цитохром b5 в микросомах выполняют функцию промежуточных переносчиков. Цитохром с легко солюбилизируется, в то время как остальные из перечисленных цитохромов прочно связаны с мембранами.
Гемовые группы всех цитохромов, образующих дыхательную цепь, не могут непосредственно контактировать друг с другом, и вопрос о том, как происходит перенос электронов между молекулами цитохромов, полностью не выяснен. Один из возможных механизмов такого переноса состоит в передаче электронов по белковой части молекулы цитохромов за счет перекрывающихся пи-электронных облаков ароматических аминокислотных остатков. Кроме того, перенос электронов между гемовыми группами, находящимися на нек-ром расстоянии друг от друга, может осуществляться по типу туннельных переходов.
Важным свойством цитохромов как Д. ф. является способность некоторых аминокислотных остатков (чаще всего гистидина и тирозина) белковой части их молекулы менять значения своего рК (константы ассоциации с протонами) при изменении электронного состояния гема. Благодаря этому окисление и восстановление гема могут приводить к выделению или поглощению апоферментом протонов на участках, которые пространственно могут быть удалены от гема. Т. о., Цитохромы способны выступать в роли переносчиков протонов в мембране и участвовать в создании трансмембранного протонного градиента (см. Мембранное равновесие, Мембраны биологические). Это наиболее убедительно показано для цитохрома b Слейтером (Е. С. Slater) и Клингенбергом (М. Klingenberg). В соответствии с хемоосмотической теорией (В. П. Скулачев) образование при переносе электронов по дыхательной цепи протонного градиента является необходимым условием сопряжения дыхания с фосфорилированием. На цитохромном отрезке дыхательной цепи имеются два пункта сопряжения: в комплексе b—c1 и на цитохромоксидазном участке.
Цитохромоксидаза — терминальный Д. ф. митохондрий — имеет сложное строение. Она состоит из 6 субъединиц с мол. весом (массой) от 5300 до 36 000. Две субъединицы составляют, по-видимому, цитохром a, a остальные четыре относятся к цитохрому a3. В переносе электронов к кислороду участвуют, помимо гемовых групп, также содержащиеся в цитохромоксидазе атомы меди, изменение валентности которых при взаимодействии с кислородом может быть обнаружено методом ЭПР.
Цитохромоксидаза связывается с окисью углерода и цианидом, которые являются, т. о., ингибиторами дыхания. На первой стадии взаимодействия цитохромоксидазы с кислородом образуется комплекс цитохромоксидаза — O2, так наз. оксигенированная форма цитохромоксидазы. Далее происходит восстановление кислорода системой из двух комплексов, находящихся в кооперативном взаимодействии, каждый из которых содержит гемовую группу и медь и способен осуществлять двухэлектронный перенос.
Цитохром Р-450, терминальный Д. ф. микросомальной гидроксилирующей системы, получил свое название благодаря образуемому им довольно прочному комплексу с CO, имеющему необычный для гемопротеидов максимум при 450 нм. Одной из наиболее интересных особенностей цитохрома P-450 является изменение его оптических свойств при образовании комплекса с различными неполярными субстратами, подвергающимися гидроксилированию в микросомах. Большинство субстратов вызывает увеличение поглощения при 385—395 нм и снижение оптической плотности при 420 нм (так наз. первый тип спектральных изменений). Методом ЭПР показано, что при образовании комплекса первого типа атом железа гемовой группы цитохрома P-450 переходит из низкоспинового в высокоспиновое состояние.
Связанная с субстратом восстановленная форма цитохрома Р-450 присоединяет кислород с образованием тройного комплекса: субстрат — восстановленный цитохром Р-450 — O2. Молекула O2 в этом комплексе частично восстанавливается, превращаясь в активированную форму, способную гидроксилировать субстрат. Механизм активации состоит, по-видимому, в том, что молекула O2, приняв два электрона, подвергается гетеролитическому расщеплению т. о., что один атом кислорода с 8 электронами отделяется в виде иона гидроксила, а другой, с 6 электронами, имея структуру атомарного кислорода, внедряется в гидроксилируемый субстрат.
В клин, практике активность некоторых Д. ф. (дегидрогеназ и др.) служит дополнительным диагностическим тестом при ряде заболеваний (см. Дегидрогеназы). Глюкозооксидаза (глюкозодегидрогеназа) используется при определении содержания в крови и в моче глюкозы (см. Городецкого методы).
Библиография: Арчаков А. И. Микросомальное окисление, М., 1975, библиогр.; Ленинджер А. Митохондрия, пер. с англ., М., 1966; Pубин Б. А. и Логинова Л. Н. Альтернативные пути биологического окисления, М., 1973; Ясайтис А. А. Превращение энергии в митохондриях, М., 1973; Biological oxidations, ed. by T. P. Singer, N. Y., 1968.
Источник
ДЕГИДРОГЕНАЗЫ
ДЕГИДРОГЕНАЗЫ — одна из самых многочисленных подгрупп ферментов, катализирующих реакции биологического окисления и восстановления, т. е. реакции, связанные с процессами дыхания, гликолиза и брожения; активность некоторых дегидрогеназ в сыворотке крови служит дополнительным диагностическим тестом при ряде заболеваний.
Дегидрогеназы широко распространены в природе. Они обнаружены во всех органах и тканях животных и растений, а также у микроорганизмов. Дегидрогеназы относятся к классу оксидоредуктаз (КФ 1.1.1; 1.1.2; 1.1.99; 1.2.1; 1.2.2; 1.2.4; 1.2.99; 1.3.1-1.3.3; 1.3.99; 1.4.1; 1.5.1; 1.6.4; 1.6.99; 1.8.5) и катализируют перенос водорода (протонов) от окисляемого субстрата (RH2) на соединения-акцепторы (R1) (но не непосредственно на кислород), которые при этом восстанавливаются:
Реакции ферментативного дегидрогенирования обратимы. Дегидрогеназы отличаются высокой специфичностью и катализируют реакции окисления строго определенного субстрата или группы родственных ему соединений.
Функции Д. в организме человека и животных весьма многообразны. С реакций, катализируемых Д., начинается большинство аэробных процессов, завершающихся переносом водорода на кислород с образованием воды в качестве конечного продукта и выделением большого количества энергии, расходуемой организмом на осуществление всевозможных жизненных функций. Такие Д., как алкогольдегидрогеназа (КФ 1.1.1.1) и лактатдегидрогеназа (КФ 1.1.1.27), завершают процессы брожения (см.) и гликолиза (см.) соответственно.
В чистом виде Д. впервые были выделены из дрожжей в лаборатории О. Варбурга: в 1937 г. — алкогольдегидрогеназа, а в 1939 г. — глицеральдегидфосфатдегидрогеназа (триозофосфатдегидрогеназа; КФ 1. 2.1.9). С тех пор большое количество разных Д. выделено в высокоочищенном состоянии из самых разнообразных источников. Д. представляют собой двухкомпонентные ферменты и состоят из белковой части (апофермента) и небелковой части, функцию к-рой в большинстве случаев выполняют никотинамидные коферменты и реже флавиновые коферменты (см. Коферменты). Ферментативная реакция, катализируемая Д., представляет собой прямой перенос атомов водорода от одной молекулы к другой (напр., в случае алкоголь- или лактатдегидрогеназы). Окисление субстрата, катализируемое Д., может быть также многоступенчатым процессом, состоящим из нескольких последовательных этапов, которые нуждаются и в других кофакторах, кроме необходимых для реакции коферментов. Примером могут служить пируватдегидрогеназа (КФ 1.2.4.1) и оксоглутаратдегидрогеназа (КФ 1.2.4.2), для функционирования которых, кроме НАД, необходимо присутствие липоевой к-ты, тиаминпирофосфата и КоА. В результате действия этих ферментов происходит не только перенос водорода, но также декарбоксилирование (см.) и перенос ацильного остатка, причем первичным акцептором водорода (протона) является липоевая к-та и только затем, при участии флавинового кофермента, водород переносится на НАД. При окислении фосфоглицеринового альдегида, катализируемом глицеральдегидфосфатдегидрогеназой (КФ 1. 2.1.12 и 1.2.1.13), происходит связывание фосфата. Эта реакция интересна тем, что энергия, освобождающаяся при окислении субстрата, аккумулируется в виде богатой энергией фосфатной связи АТФ (т. е. происходит так наз. субстратное фосфорилирование).
Большинство Д. для своего действия нуждается в присутствии ионов двухвалентных металлов, которые, по-видимому, стабилизируют активную структуру молекулы фермента и участвуют в активации субстрата.
Первичная структура Д., выделенных из различных источников, весьма сходна, особенно в отношении аминокислотных остатков, важных для осуществления каталитического акта. Пространственное расположение полипептидной цепи в области активного центра НАД-зависимых Д. имеет большое сходство, что указывает на генетическую связь между этими ферментами. Строение активных центров ФАД- и НАД-зависимых Д. различно.
Как правило, Д. характеризуются наличием четвертичной структуры, т. е. молекулы индивидуальных ферментов состоят из различного количества субъединиц. Субъединицы часто ферментативной активностью не обладают (это четко показано для НАД- и НАДФ-зависимых Д.), она появляется только в результате ассоциации субъединиц в олигомер — активную молекулу фермента.
Взаимодействие субъединиц в олигомере может приводить к кооперативности в функционировании активных центров фермента. Регуляция активности Д. может осуществляться путем взаимодействия с аллостерическими эффекторами — метаболитами, связывающимися на особых участках поверхности молекулы фермента. Наиболее типичными представителями регуляторных Д. являются глутамат- и липоамиддегидрогеназы.
Для многих Д. охарактеризованы функциональные группы, участвующие в катализе, в связывании кофермента и субстрата. Наиболее изученными с этой точки зрения являются НАД- и НАДФ-зависимые Д. Остатки тирозина, гистидина и аспарагиновой к-ты принимают участие в связывании кофермента; роль кислотно-основного катализатора играет либо остаток гистидина, либо ион металла. Большинство НАД-зависимых Д. инактивируется при добавлении реагентов на сульфгидрильные (SH-) группы, напр, пара-хлормеркурибензоата. Реактивация происходит при добавлении цистеина или глутатиона (см.). Кофермент, находящийся в р-ре, обладает защитным действием в отношении комплексов фермент — кофермент при инактивации SH-реагентами. Многочисленные данные указывают на то, что SH-группы располагаются в активном центре Д. или в непосредственной близости от него и участвуют в каталитическом акте, осуществляемом ферментом.
Большинство НАД- и НАДФ-зависимых Д. специфичны по отношению к своим кофакторам; в то же время все исследованные Д. оказались стереоспецифичными, причем одни из них при ферментативном восстановлении НАД (НАДФ) отщепляют и присоединяют водород по одну сторону пиридинового кольца молекулы кофермента, а другие — по другую, противоположную. Источник, из к-рого выделен фермент, в этом случае роли не играет, т. е. однотипные ферменты, выделенные из разных органов или тканей, имеют одну и ту же стереоспецифичность. Если фермент активен с НАД и с НАДФ, то стереоспецифичность одинакова по отношению к обоим коферментам. Наличие стереоспецифичности может иметь физиол, значение, обеспечивая возможность эффективного переноса водорода с одного субстрата на другой за счет последовательного действия двух функционально связанных Д.
Методы измерения активности
Существует несколько методов измерения активности Д.
1. По скорости обесцвечивания метиленового синего. В основе этого метода лежит тот факт, что окисленная форма метиленового синего окрашена, а восстановленная — бесцветна. Измеряя в присутствии соответствующего субстрата скорость обесцвечивания индикатора, определяют величину дегидрогеназной активности. Исследования обычно проводят в анаэробных условиях, т. к. метиленовый синий легко окисляется кислородом воздуха (при измерении в аэробных условиях скорость дегидрогеназной реакции определяют манометрически по количеству поглощенного кислорода). Метод с метиленовым синим применим для исследования активности Д. в гистол, препаратах и активности очищенных ферментов, но в последнем случае в реакционную смесь необходимо добавлять флавиновый фермент, способный катализировать перенос электронов и протонов от Д. на метиленовый синий.
2. Метод с применением трифенилтетразолия, используемого в качестве акцептора водорода, бесцветного в окисленной форме и окрашенного — в восстановленной. Активность Д. в этом случае определяют по интенсивности появляющейся окраски. Преимущество данного метода заключается в том, что трифенилтетразолий, в противоположность метиленовому синему, не окисляется на воздухе и проведение реакции не требует создания анаэробных условий.
3. Спектрофотометрический метод. Восстановление никотинамидных коферментов в процессе ферментативной реакции сопровождается появлением нового максимума поглощения в ультрафиолетовой части спектра. Оба кофермента до присоединения протона имеют полосу поглощения с максимумом при 260 нм, после восстановления кофермента в спектре НАД•H появляется вторая полоса поглощения с максимумом при 340 нм. Этим часто пользуются как для количественного определения НАД и НАДФ, так и для измерения активности НАД (НАДФ) -зависимых Д. Интенсивность полосы поглощения пропорциональна количеству образовавшейся восстановленной формы кофермента. Скорость окисления восстановленных форм НАД и НАДФ можно определять по уменьшению величины оптической плотности при 340 нм. Данный метод является специфичным, легко воспроизводимым и точным. Обычно именно он используется при работе с чистыми ферментами.
Отсутствие или понижение активности Д. в организме может вызывать целый ряд заболеваний. Так, причиной врожденной гемолитической анемии (см.) может быть снижение в эритроцитах активности НАДФ-зависимой глюкозо-6-фосфат — дегидрогеназы (Г6ФДГ), катализирующей окисление глюкозо-6-фосфата с образованием восстановленного НАДФ. Последний необходим для поддержания нормальной концентрации восстановленного глутатиона в эритроцитах. Существенную роль при низкой активности Г6ФДГ играет уменьшение образования АТФ, приводящее к задержке ионов Na+ и связанной с ними воды в эритроцитах, их набуханию и гемолизу. При полном отсутствии фермента гемолитическая анемия проявляется спонтанно уже в раннем детском возрасте. Если фермент имеется, но активность его понижена, то болезнь может быть спровоцирована поступлением в организм таких лекарственных веществ, как примахин, сульфаниламиды, фенацетин и др., употреблением в пищу конских бобов (Vicia fava) и пр. Для диагностики заболеваний, связанных с нарушением нормальной активности Г6ФДГ в эритроцитах, используют метод Мотульского—Кемпбелла. Для этого берут гемолизированную кровь, к к-рой добавляют глюкозо-6-фосфат, НАДФ и бриллиант-крезоловый синий. При наличии Г6ФДГ происходит образование восстановленной формы НАДФ, к-рая в свою очередь восстанавливает краситель, вызывая его обесцвечивание. Чем выше содержание фермента, тем меньше времени требуется для полного обесцвечивания индикатора. В норме р-р индикатора обесцвечивается за 40—55 мин., максимально — за 90 мин. Если время обесцвечивания длительнее, это свидетельствует о недостаточности Г6ФДГ.
Причиной гемолитической анемии может быть также снижение активности другой Д.— глутатионредуктазы (КФ1.6.4.2) при нормальном содержании восстановленного НАДФ в эритроцитах. Этот фермент катализирует восстановление глутатиона за счет восстановленного НАДФ. При его недостатке патологически снижается концентрация восстановленного глутатиона.
При мегалобластических анемиях активность Г6ФДГ в эритроцитах повышается. Активность Г6ФДГ в эритроцитах определяется спектрофотометрически по количеству восстановленного НАДФ. Активность фермента выражают числом единиц на 10 9 эритроцитов (за единицу принимают количество фермента, к-рое при 25° и конечном объеме реакционной смеси 3 мл изменяет оптическую плотность НАДФ-H при 340 нм на 0,001 в 1 мин. на 1 мл гемолизата крови). В эритроцитах здоровых людей активность Г6ФДГ равна 272±26/10 9 эритроцитов. Определение активности Д. в биол, жидкостях организма может служить важным диагностическим тестом. Значительное увеличение активности ряда Д. (лактат-, оксибутират-, изоцитрат-, малат-, глицеральдегидфосфатдегидрогеназ) в сыворотке крови может, как правило, свидетельствовать о тяжелых повреждениях жизненно важных органов, о гибели большого числа клеток или о существенном нарушении проницаемости клеточных мембран и гистогематических барьеров. При некоторых формах анемий в крови повышается активность малатдегидрогеназы (КФ 1.1.1.37) и изоцитрат-дегидрогеназы (КФ 1.1.1.42). При острых и хрон, нефритах, при опухолях в мочевыводящих путях повышается активность лактатдегидрогеназы (см.). При менингитах и опухолях мозга повышается активность лактатдегидрогеназы в цереброспинальной жидкости. При некоторых формах желтухи в крови повышается активность глутаматдегидрогеназы (КФ 1.4.1.3); значительное увеличение ее активности при острых гепатитах обычно является свидетельством тяжелого повреждения клеток печени.
Сорбитолдегидрогеназа содержится преимущественно (или исключительно) в клетках печени. В нормальной сыворотке крови этого фермента практически нет, и его появление указывает на повреждение паренхимы печени (инфекция, токсическое повреждение, гипоксия органа). Активность сорбитолдегидрогеназы в сыворотке крови здоровых людей составляет менее 1 ед. на 1 мл (1 единица равна количеству фермента, содержащегося в 1 мл сыворотки крови и вызывающего изменение оптической плотности на 0,001 в 1 мин. при 360 нм и 24 ° при конечном объеме реакционной смеси 3 мл и толщине ее слоя в спектрофотометрической кювете 1 см).
Большое распространение в клинике получило определение не общего содержания фермента, а абсолютного или относительного количества его множественных форм, так наз. изоферментов (см.). Напр., одна из таких форм лактатдегидрогеназы находится преимущественно в сердце, а другая — в печени (ЛДГ-1 и ЛДГ-5). Поэтому увеличение в сыворотке крови относительного и абсолютного количества ЛДГ-1 наблюдается при инфаркте миокарда, а ЛДГ-5 — при различных видах гепатита.
Гистохимические методы выявления дегидрогеназ в тканях
В гистохим, реакциях при определении Д. используются соли тетразолия, служащие акцепторами электронов, донорами которых является окисляемый субстрат, и восстанавливающиеся до нерастворимого в воде формазана. Особенно широко используется нитро-синий тетразолий (НСТ). Эта соль нерастворима в жирах, достаточно устойчива к действию света и имеет выраженное сродство к белку, что предотвращает кристаллизацию формазана НСT во время инкубации. Для выявления Д. необходима максимально высокая скорость реакции, т. к. продолжительная инкубация препарата приводит к повреждению митохондрий, а также потому, что при малой скорости другие электронные акцепторы, имеющиеся в тканях, могут перехватить электроны, оставляя соль тетразолия невосстановленной. Продуктами дегидрогеназных реакций часто являются кетоны и альдегиды; для сдвига равновесия ферментативной реакции в сторону образования этих продуктов необходимо повышать концентрацию субстрата и удалять продукт реакции при помощи реагентов, связывающих карбонильные группы. С этой целью в инкубационную среду вводят цианид, димедон, фенилгидразин, семикарбазид.
Инкубационная среда готовится непосредственно перед употреблением. Срезы свежезамороженной ткани, приготовленные в криостате, наклеивают на покровные или предметные стекла и помещают в инкубационную среду на 5—30 мин. при 37 °. После инкубации срезы промывают дист, водой и фиксируют в 10% формалин-кальциевом р-ре в течение 10 мин., затем снова промывают в дист, воде и заключают в глицерин-желатину. Темный осадок формазана обнаруживается в структурах, обладающих дегидрогеназной активностью. Система сукцинатдегидрогеназы для гистохим, определения не требует коферментов; продукт ферментативной реакции не тормозит реакцию, и поэтому нет необходимости вводить связывающий его агент. Гистохим, техника такая же, как и для других Д. Для проверки специфичности реакций необходимо из инкубационной среды исключить специфический для Д. субстрат или нагревать срезы при 80 ° в течение 1 часа, чтобы полностью инактивировать ферменты. При определении специфичности реакции на сукцинатдегидрогеназу можно, кроме того, использовать малоновую к-ту (в концентрации 3—4 мг/мл), к-рая тормозит активность сукцинатдегидрогеназы.
Диагностическая ценность определения активности Д. несомненна, поэтому перечень Д., активность которых в биол, жидкостях может служить прямым или вспомогательным диагностическим тестом, расширяется.
Библиография: Аллостерические ферменты, под ред. В. Л. Кретовича, Итоги науки и техники, Серия биол, хим., т. 3, М., 1975;
Ленинджер А. Биохимия, пер. с англ., М., 1976; Лилли Р. Патогистологическая техника и практическая гистохимия, пер. с англ., М., 1969; Пирс Э. Гистохимия, пер. с англ., М., 1962; Цитология ферментов, пер. с англ., под ред. А. А. Покровского, М., 1971.
Г. А. Кочетов; А. Г. Уфимцева (гистохим.).
Источник