Биотехнология получения первичных метаболитов витаминов органических кислот кратко

Чачина С.Б. Лекции по микробиологии и биотехнологии — файл n12.doc

Чачина С.Б. Лекции по микробиологии и биотехнологии
скачать (2539.4 kb.)
Доступные файлы (19):

n12.doc

БИОТЕХНОЛОГИЯ ПРОИЗВОДСТВА МЕТАБОЛИТОВ

1. КЛАССИФИКАЦИЯ ПРОДУКТОВ БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИХ ПРОИЗВОДСТВ

Спектр продуктов, образующихся методами биотехнологии, необычайно широк и разнообразен. Од­ноклеточные организмы используют для получения биомассы, являющейся источником кормового белка. Клетки, особенно в иммобилизованном состоянии, выступают в роли биологических катализаторов для процессов биотрансформации.

Процессами биотрансформации называют реакции превращения исходных органических соединений (предшественников) в целе­вой продукт с помощью клеток живых организмов или фермен­тов, выделенных из них. В последние годы высокая специфичность процессов биотрансформации и эффективность иммобилизован­ных ферментов нашли широкое применение для крупномасштаб­ного производства аминокислот, антибиотиков, стероидов и дру­гих промышленно важных продуктов.

Продуктами биотехнологических производств являются при­родные макромолекулы — белки, ферменты, полисахариды.

Первичные метаболиты необходимы для роста клеток. К ним относятся структурные единицы биополимеров — аминокислоты, нуклеотиды, моносахариды, а также витамины, коферменты, органические кислоты и другие соединения. Вто­ричные метаболиты (антибиотики, пигменты, токсины) — низ­комолекулярные соединения, не требующиеся для выживания клеток и образующиеся по завершении фазы их роста.

Центральное звено биотехнологического процесса — живая клетка, в которой одномоментно синтезируется великое множе­ство разнообразных соединений. В норме обмен веществ в клетке осуществляется по принципам строжайшей экономии, что обес­печивается сложнейшей системой регуляции обмена веществ. За­дача биотехнолога состоит в обеспечении сверхсинтеза одного из продуктов метаболизма, что достигается как путем изменения ге­нетической программы организма, так и посредством нарушения регуляторных систем метаболизма в нем.
2. БИОТЕХНОЛОГИЯ ПОЛУЧЕНИЯ ПЕРВИЧНЫХ МЕТАБОЛИТОВ

2.1. Производство аминокислот

Среди соединений, получаемых биотехнологическими методами, аминокислоты занимают первое место по объему производства и второе место по стоимости, уступая по последнему параметру лишь антибиотикам. Объем мирового производства аминокислот со­ставляет более 500 тыс. т в год, из которых 300 тыс. т приходится на глутамат натрия, 100 тыс. т на лизин и 140 тыс. т на метионин. Одна­ко указанный объем — лишь небольшая доля от требуемого коли­чества аминокислот. По данным ВОЗ, потребность человечества всего лишь в четырех незаменимых аминокислотах составляет, млн т: для лизина — 5, метионина — 4, треонина — 3,7 и триптофана — 2.

Аминокислоты — структурные единицы белков. Природные ами­нокислоты вовлечены в биосинтез ферментов, ряда гормонов, витаминов, антибиотиков, алкалоидов, токсинов и других азот­содержащих соединений (пурины, пиримидины, гем и пр.). В орга­низме животного практически половина белковых аминокислот не синтезируется. Они называются незаменимыми аминокислотами и должны поступать в организм с пищей. Недостаток каждой из этих аминокислот в пищевом или кормовом рационе приводит к нарушению обмена веществ, замедлению роста и развития.

Помимо применения в качестве пищевых добавок, приправ и усилителей вкуса аминокислоты используют как сырье в хими­ческой, парфюмерной и фармацевтической промышленности и при производстве ряда других веществ:

глицин — подсластитель, антиоксидант, бактериостатик;

аспарагиновая кислота — усилитель вкуса, сырье для синтеза аспартама;

глутаминовая кислота — усилитель вкуса, препарат для лече­ния психических заболеваний;

гистидин — противовоспалительное средство;

метионин — пищевая и кормовая добавки;

цистеин — фармацевтический препарат;

треонин и триптофан — пищевые и кормовые добавки;

фенилаланин — сырье для получения аспартама;

лизин — пищевая и кормовая добавки, сырье для получения искусственных волокон и пленок.

В промышленных масштабах белковые аминокислоты получают:

1. гидролизом природного белоксодержащего сырья;
2. химическим синтезом;
3. микробиологическим синтезом;
4. биотрансформацией предшественников аминокислот с по­
   мощью микроорганизмов или выделенных из них ферментов (хи­
   мико-микробиологический метод).

Существенный недостаток методов химического синтеза ами­нокислот состоит в получении целевых препаратов в виде раце­мической смеси D- и L-стереоизомерных форм. Подавляющее боль­шинство природных аминокислот относится к L-ряду. D-a-ами-нокислоты обнаружены лишь в составе гликопротеинов клеточ­ных стенок бактерий, антибиотиков и некоторых токсинов.? Про­ницаемость L-аминокислот в клетке в 500 раз превышает таковую ее антипода. Стереоспецифичны также транспорт и метаболизм аминокислот. Исключением в этом отношении является лишь ме-тионин, метаболизм которого нестереоизбирателен, благодаря чему данная аминокислота получается преимущественно путем хими­ческого синтеза. Разделение рацематов других аминокислот — до­рогая и чрезвычайно трудоемкая процедура.

Наиболее перспективен и экономически выгоден микробиоло­гический синтез аминокислот. Более 60 % всех производимых в на­стоящее время промышленностью высокоочищенных препаратов белковых аминокислот получают именно этим способом, главное преимущество которого в сравнении с методами химического син­теза состоит в возможности получения L-аминокислот на основе возобновляемого сырья.
Перспективные штаммы продуцентов постоянно улучшают по­средством селекции мутантов с измененной генетической про­граммой и регуляторными свойствами. Распространенные объек­ты селекции продуцентов — микроорганизмы, относящиеся к родам Brevibacterium, Micrococcus, Corynebacterium, Arthrobacter (табл. 1).

Микроорганизмы — продуценты аминокислот

(по Н. Б. Градовой и О. А. Решетник, 1987)

2. 2. Производство витаминов

Витамины представляют собой группу незаменимых органи­ческих соединений различной химической природы, необходи­мых любому организму в ничтожных концентрациях и выполняю­щих в нем каталитические и регуляторные функции. Недостаток того или иного витамина нарушает обмен веществ и нормальные процессы жизнедеятельности организма, приводя к развитию па­тологических состояний. Витамины не образуются у гетеротрофов. Способностью к синтезу витаминов обладают лишь автотрофы, в частности растения. Многие микроорганизмы также образуют це­лый ряд витаминов, поэтому синтез витаминов с помощью мик­роорганизмов стал основой для разработки технологий промыш­ленного производства этих биологически активных соединений.

Благодаря изучению физиологии и генетики микроорганизмов — продуцентов витаминов и выяснению путей биосинтеза каждого из них создана теоретическая основа для получения микробиологи­ческим способом практически всех известных в настоящее время витаминов. Однако с помощью энзимов целесообразнее произво­дить лишь особо сложные по строению витамины: В₂, В₁₂, (3-каротин (провитамин А) и предшественники витамина D. Осталь­ные витамины либо выделяют из природных источников, либо синтезируют химическим путем. Витамины используются в каче­стве лечебных препаратов, для создания сбалансированных пи­щевых и кормовых рационов и для интенсификации биотехноло­гических процессов.
Получение витамина В₂ (рибофлавин).

Вплоть до 30-х годов прошлого столетия рибофлавин выделяли из природного сырья. В наибольшей концентрации он присутствует в моркови и печени трески. Из 1 т моркови можно изолировать лишь 1 г рибофлавина, а из 1 т печени — 6 г. В 1935 г. обнаружен активный продуцент рибофлавина — гриб Eremothecium ashbyii, способный при выра­щивании на 1 т питательной смеси синтезировать 25 кг витамина В₂. Сверхсинтеза рибофлавина добиваются действием на дикие, штаммы мутагенов, нарушающих механизм ретроингибирования I синтеза витамина В₂, флавиновыми нуклеотидами, а также изменением состава культуральной среды.

В состав среды для роста продуцентов витамина В₂ входят до­статочно сложные органические вещества — соевая мука, куку­рузный экстракт, сахароза, карбонат кальция, хлорид натрия, гидрофосфат калия, витамины, технический жир. Грибы весьма чувствительны к изменению состава среды и подвержены инфи­цированию. Перед подачей в ферментер среду подвергают стери­лизации, добавляя к ней антибиотики и антисептики. Подготав­ливают жидкую питательную среду и посевной материал культу­ры дрожжей в разных емкостях — ферментере и посевном аппа­рате.

В качестве посевного материала используют споры Е. ashbyii, выращенные на пшене (7 — 8 дней при 29 — 30 °С). После стерили­зации жидкий посевной материал подается в ферментер. Процесс ферментации грибов для получения кормового рибофлавина длится 3 суток при температуре 28 — 30 °С. Концентрация рибофлавина в культуральной жидкости может достигать 1,4 мг/мл. По заверше­нии процесса ферментации культуральную жидкость концентри­руют в вакууме, высушивают на распылительной сушилке (влаж­ность 5 — 10%) и смешивают с наполнителями.

Витамин В₁₂ открыт в 1948 г. одновременно в США и Англии. В 1972 г. в Гарвардском университете был осуще­ствлен химический синтез корриноидного предшественника ви­тамина В₁₂. Химический синтез корнестерона — структурного эле­мента корринового кольца витамина, включающий 37 стадий, в крупных масштабах не воспроизведен из-за сложности процесса.

Витамин В₁₂ регулирует углеводный и липидный обмен, уча­ствует в метаболизме незаменимых аминокислот, пуриновых и пиримидиновых оснований, стимулирует образование предшественни­ков гемоглобина в костном мозге; применяется в медицине для лечения злокачественной анемии, лучевой болезни, заболеваний печени, полиневрита и т. п. Добавление витамина к кормам способ­ствует более полноценному усвоению растительных белков и повыша­ет продуктивность сельскохозяйственных животных на 10—15 %.

Первоначально витамин В_]2 получали исключительно из при­родного сырья, но из 1 т печени можно было выделить всего лишь 15 мг витамина. Единственный способ его получения в настоящее время — микробиологический синтез. Обнаружение витамина в качестве побочного продукта при производстве антибиотиков в значительной степени стимулировало поиск организмов-проду­центов витамина и изучение путей его образования. Однако меха­низмы регуляции биосинтеза витамина В₁₂ до настоящего време­ни полностью не расшифрованы. Известно, что при высоких кон­центрациях витамин полностью репрессирует синтез ключевых ферментов своего новообразования.

Продуцентами витамина В₁₂ при его промышленном получе­нии служат актиномицеты, метанообразующие и фотосинтезирующие бактерии, одноклеточные водоросли.

В 70-х годах XX в. ин­терес ученых привлекли пропионовокислые бактерии, известные еще с 1906 г. и широко использующиеся для приготовления пре­паратов животноводства. Выделено 14 видов пропионовокислых бактерий, продуцирующих витамин В₁₂;

Из культуральной жидкости витамин В,₂ выделяют экстракцией органическими растворителями, ионообменной хроматографией с последующим осаждением из фракций в виде труднораствори­мых соединений. В процессе получения витамина В₁₂ с помощью пропионовокислых бактерий применяют дорогостоящую антикор­розийную аппаратуру, сложные и дорогие питательные среды. Усовершенствование технологического процесса идет в направ­лении удешевления компонентов питательных сред (замена глю­козы сульфитными щелоками) и перехода с периодического культивирования на непрерывный процесс. В последние годы исследу­ется возможность получения витамина с использованием иммо­билизованных клеток пропионовокислых бактерий.

Для нужд животноводства сотрудниками Института биохимии им. А. Н. Баха РАН разработана более простая и дешевая техноло­гия получения витамина В₁₂.

По указанной технологии ферментацию осуществляет слож­ный биоценоз термофильных микроорганизмов, производящих ме­тановое брожение. Комплекс микроорганизмов включает целлюлозоразлагающие, углеводсбраживающие, аммонифицирующие, сульфитвосстанавливающие и метанообразующие бактерии. На первой фазе процесса (10 —12 дней) развиваются термофильные углеводсбраживающие и аммонифицирующие бактерии. При этом в слабокислой среде (рН 5,0 — 7,0) органические соединения пре­вращаются в жирные кислоты и аммиак. На второй фазе, когда среду подщелачивают до рН 8,5, в биоценозе преобладают мета­нообразующие бактерии, которые сбраживают возникающие на первой фазе продукты до метана и диоксида углерода. Именно метанообразующие бактерии — главные продуценты витамина. Обо­гащение сред очищенными культурами метанообразующих бакте­рий увеличивает выход активных форм витамина В₁₂.
Получение Витамина А и витамина D₂.

1. Важное место в обмене веществ у животных занимает р-каротин, который в печени пре­вращается в витамин А (ретинол). В организме человека и живот­ных каротины не образуются. Основные источники Р-каротина для животных — растительные корма; человек получает Р-каротин также из продуктов животного происхождения. Р-Каротин можно выделить из ряда растительных объектов — моркови, тыквы, об­лепихи, люцерны. В начале 60-х годов XX в. разработана схема мик­робиологического синтеза Р-каротина, которая стала основой про­мышленного способа его получения. Установлено, что многие мик­роорганизмы — фототрофные бактерии, актиномицеты, плесне­вые грибы, дрожжи — синтезируют каротин) Характерно, что со­держание р-каротина у микроорганизмов во много раз превышает содержание этого провитамина у растений. Так, в 1 г моркови присутствует всего 60 мкг Р-каротина, в то время как в 1 г био­массы гриба Blaneslea trispora — 3 — 8 тыс. мкг.

Разработаны опыт­ные установки как периодического, так и непрерывного действия для синтеза Р-каротина, основной недостаток которых — высокая стоимость сырья и большая длительность процесса.

2. Микробиологическим способом получают и витамин D₂ (эрго-/кальциферол), при производстве которого освоено дешевое сы­рье (углеводороды) и установлен стимулирующий эффект ульт­рафиолетовых лучей на синтез эргостерина культурой дрожжей.
3. Производство органических кислот

В настоящее время биотехнологическими способами в промыш­ленных масштабах синтезируют ряд органических кислот. Из них лимонную, глюконовую, кетоглюконовую и итаконовую кислоты получают лишь микробиологическим способом, молочную, салици­ловую и уксусную — как химическим, так и микробиологическим способами, а яблочную — химическим и энзиматическим путем.

Получение уксусной кислоты.

Уксусная кислота имеет наибо­лее важное значение среди всех органических кислот. Ее исполь­зуют при выработке многих химических веществ, включая кау­чук, пластмассы, волокна, инсектициды. Микробиологический способ получения уксусной кислоты состоит в конверсии этанола в уксусную кислоту при участии бактерий штаммов Acetobacter и Gluconobacter.

Этанол «НАДН+Н + ^^ -НАДН+Н+ _{Уксусная}

кислота
Процесс идет в анаэробных условиях в режиме непрерывного культивирования продуцента. Для роста бактерии Acetobacter aceti используют питательные среды, содержащие 6 — 12% этилового спирта, 1 % бактериального гидролизата, 0,05 % дигидрофосфата калия, 0,1 % гидрофосфата аммония и 0,05% сульфата магния. Максимальная удельная активность непрерывной культуры A. aceti (количество микрограммов субстрата, подвергшегося окислению 1мкг биомассы за 1 мин) достигается к 20-м суткам культивиро­вания при концентрации спирта 7 % и составляет 3,0 ед./мг.

Получение лимонной кислоты.

Лимонную кислоту широко ис­пользуют в пищевой, фармацевтической и косметической промыш­ленности. Ею заменяют фосфаты в составе детергентов, так как она полностью метаболизируется живыми организмами. Лимон­ная кислота образует хелаты с металлами, поэтому ее применя­ют для их очистки. Объем мирового производства цитрата состав­ляет 400 тыс. т/год. Самый крупный производитель лимонной кисло­ты — США. Производство лимонной кислоты принадлежит к числу старейших промышленных микробиологических процессов: оно было организовано в 1893 г. С этого момента параллельно развитию фундаментальной микробиологии велись изыскания оптимальных продуцентов и технологических вариантов процесса ферментации.

Для промышленного производства лимонной кислоты ис­пользуют главным образом культуру гриба Aspergillus niger, а также A. went П.

Метаболическим источником лимонной кислоты в организме служит цикл трикарбоновых кислот — составная часть цикла Кребса. Суммарное уравнение химических процессов этого цикла сле­дующее:

О -— 2СО₂ + ЗНАДН + ЗН + + ФАДН₂ + ГТФ + HSKoA

4. Получение антибиотиков

В мире ежегодно производится антибиотиков почти на 20 млрд долларов. К числу антибиотиков относятся важнейшие противомикробные и противоопухолевые препараты; Открытие антибио­тиков произвело переворот в лечении инфекционных заболева­ний.

К антибиотикам относятся низкомолекулярные эффекторы изначально природного происхождения, способные подавлять рост живых клеток. Антибиотики, продуцируемые растительными объек­тами, называют фитонцидами.

Способность нитчатого гриба зеленой плесени Penicilliumnotation вызывать гибель микроорганизмов впервые была установлена в 1928 г. английским микробиологом А. Флеммингом. Однако лечеб­ные свойства этой плесени были описаны еще в 1871 г. русским дерматологом А. Г. Полотебновым. Количество открываемых анти­биотиков постоянно растет. В 1940 г. было известно всего 6 антиби­отиков, а в настоящее время описано более 12 000 аналогичных соединений, из которых в клинике применяют около 200 препара­тов. 97 % известных антибиотиков токсичны, поэтому в практике не используются. В химическом отношении они представляют сборную группу органических веществ. В зависимости от химической природы и ряда других свойств известные антибиотики делят на ряд классов:

1. (З-Лактамные (пенициллины, цефалоспорины) составляют
   более 50 % рынка антибиотиков.
2. Тетрациклины (тетрациклин, морфоциклин, метациклин).
3. Макролиды (эритромицин, олеандомицин).
4. Аминогликозиды (гентамицин, амикацин).
5. Гликопептиды (ванкомицин, ристомицин).
6. Амфениколы (левомицетин).
7. Линкосамиды (линкомицин).
8. Полиеновые [противогрибковые (нистатин, леворин)].
9. Противоопухолевые (блеомицин) и др.

Большой вклад в установление структуры ряда антибиотиков внесли М. М. Шемякин, Ю. А. Овчинников, В. Т. Иванов, А. С. Хох­лов, Г.Б.Локшин, М.Н.Колосов, Ю.А.Берлин, Е.С.Есипов, А.Д.Кузовнов.

По типу действия антибиотики делят на бактерицидные (лактамные, аминогликозиды), вызывающие гибель микроорганизмов, и бактериостатические (макролиды, тетрациклины, левомицетин), нарушающие способность микроорганизмов делиться. По спектру действия различают антибиотики узкого и широкого действия. К последним относят тетрациклины, макролиды, аминогликозиды, которые особенно полезны в случае неидентифицированных воз­будителей болезни, однако при длительном применении они вызывают у пациентов дисбактериоз.

Таким образом, антибиотики бло­кируют метаболические мишени в клетках-мишенях. В зависимости от специфики действия антибиотиков на молекулярном уровне раз­личают следующие группы соединений, вызывающие у бактерий:

1. нарушение биосинтеза пептидогликанов клеточной стенки
   (пенициллины, ванкомицин, цефалоспорины);
2. нарушение отдельных этапов процессов трансляции (амфени-
   колы, аминогликозиды, тетрациклины, макролиды, линкосамиды);
3. повреждения цитоплазматической мембраны (грамицидин,
   полимиксины);
4. нарушение биосинтеза нуклеиновых кислот (рифамицины,
   актиномицин D, противоопухолевые антибиотики);
5. нарушение энергетического обмена (олигомицин, хлоргек-
   сидин).

Антибиотики широко используют в качестве молекулярных инструментов при исследовании фундаментальных проблем био­логии, таких, как расшифровка тончайших механизмов биосин­теза белка, нуклеиновых кислот и структуры клеточных стенок бактерий, создание моделей транспорта ионов через биологичес­кие мембраны и др.

Методы получения антибиотиков путем химического синтеза чрезвычайно сложны и не могут конкурировать с их биосинтезом методами биотехнологии.

Существует несколько способов получе­ния как природных, так и полусинтетических антибиотиков.

1- На­правленный биосинтез антибиотиков осуществляется путем пря­мой ферментации микроорганизма — продуцента с подходящим предшественником, что индуцирует синтез ферментов вторично­го метаболизма в идиофазе. Точный механизм индуцирования пер­вичными метаболитами генов, кодирующих синтез ферментов вторичного метаболизма, не расшифрован, однако выявлено, что молекулы предшественника необходимо добавлять в среду в пе­риод фазы роста микроорганизмаэ

2 — Другой способ получения антибиотиков состоит в использова­нии для их биосинтеза блокированных мутантов, у которых отсут­ствует (блокировано) определенное звено в цепи реакций, веду­щих к синтезу антибиотика. Блокированные мутанты не способны образовывать нужный антибиотик. Используя низкую субстратную специфичность ферментов вторичного метаболизма и вводя ана­логи предшественников антибиотика, последние переводят в ана­логи самого антибиотика в ходе процесса, известного как мута­ционный биосинтез, или мутасинтез:

Источник