Биотехнологические способы производства витаминов

Раздел 3. Биотехнология аминокислот,витаминов и коферментов.

Тема : Получение аминокислот, витаминов и коферментов биотехнологическими методами и с помощью иммобилизованных клеток и ферментов. Конструирование штаммов-продуцентов и оптимизация условий ферментации.

Задача 14.

В процессе промышленного производства аскорбиновой кислоты используют многостадийный химический синтез, в который наряду с тонкими химическими реакциями встроена и технологически необходимая биосинтетическая реакция, что является одним из примеров успешного сочетания органического синтеза с биосинтезом.

При проведении технологического этапа биосинтеза на производстве применяют определенные микроорганизмы, осуществляющие биосинтетические реакции. Не менее важными являются оптимизация условий ферментации и контроль за количеством биомассы микроорганизмов в ферментационном аппарате.

Проанализируйте ситуацию с точки зрения:

· химической реакции биотрансформации, определяющей проведение биосинтеза и получение ожидаемого результата при осуществлении биотрансформации;

· выбора микроорганизмов для биоконверсии и оптимального подбора компонентов питательной среды (источников углерода, азота и фосфора);

· возможности увеличения выхода целевого продукта.

Ответ:

Синтез аскорбиновой кислоты по А. Грюсснеру и М. Рейхшейну с 1934 г. представляет собой многостадийный и преимущественно химический процесс, в котором имеется лишь одна стадия биотрансформации D-сорбита в L-сорбозу с участием уксуснокислых бактерий как классический пример микробиологического производства. Для получения сорбозы культуру продуцента Gluconobaderoxydans выращивают в ферментерах периодического действия, оснащенных мешалками и барботерами для усиления аэрации в течение 20-40 ч. Выход сорбозы достигает 98% от исходного сорбита. Питательные среды содержат кукурузный или дрожжевой экстракт (20% от общего количества). По окончании производственного цикла сорбозу выделяют из культуральной жидкости. Совершенствование этой стадии в части повышения выхода целевого продукта при переходе от периодического культивирования продуцента Gluconobacteroxydans к непрерывному в аппарате колонного типа позволило увеличить скорость образования сорбозы в 1,7 раза. Также можно привести пример получения 2-кето-β-гулоновой кислоты (промежуточный продукт синтеза витамина С), которая легко превращается в аскорбиновую кислоту. Это метод двух-стадийного микробиологического синтеза, включающий окисление D-глюкозы в 2, 5-дикето-О-глюконовую кислоту с дальнейшейбиотрансформацией в 2-кето-β-гулоновую кислоту. Наиболее продуктивными микроорганизмами, осуществляющими эту реакцию, являются представители родов Acetobacter, Erwinia, Gluconobacter, в частности мутантный штамм Erwiniapunctate, который обеспечивает выход до 94,5% 2, 5-дикето-О-глюконовой кислоты от общего количества исходной глюкозы.

Задача 15.

При получении штаммов суперпродуцентов аминокислот, таких, как треонина или лизина, используют микроорганизмы Escherichiacoli, Corynebacteriumglutamicum, Brevibacteriumflavum, Bacillussubtilis. В одном случае биосинтез аминокислоты идет одновременно с ростом биомассы (путь получения аминокислоты одностадийный), в другом случае сначала идет рост биомассы и только потом синтез аминокислоты (путь двухстадийный).

В данной ситуации получения аминокислот обоснуйте: — преимущества биосинтеза перед органическим синтезом и подбор соответствующих микроорганизмов для получения штаммов-продуцентов, способных к сверхсинтезу нужной аминокислоты, если конечным продуктом будет лизин или треонин:

· выбор пути биосинтеза для лизина или треонина и особенности питательных сред;

· условия ферментации (подготовительная стадия и биосинтез).

Ответ:

Современными методами тонкого органического синтеза можно синтезировать D и L-формы аминокислот в любых количествах, но все существующие способы их производства приводят к образованию рацематов. Таким путем можно получать рацематы лизина, глутаминовой кислоты, триптофана и других аминокислот. Вместе с тем химический синтез невозможен без достаточно большого количества агрессивных и токсичных веществ, что требует проведения дополнительных организационных мероприятий и финансовых затрат для их утилизации. Кроме того, подобные соединения небезопасны для персонала. Получение 100% биологически активной L-формы аминокислот методом органического синтеза — процесс очень сложный и экономически оправдан лишь в редких случаях. Альтернативой химическому синтезу служит микробиологический процесс, при котором специально подобранные селекционные или сконструированные методами генной инженерии штаммы-продуценты способны осуществлять сверхсинтез аминокислот, например L-лизина, L-глутаминовой кислоты, L-триптофана, L-треонина в значительных количествах, что является определяющим фактором при выборе технологиипроизводства аминокислот в промышленном масштабе. Однако при биосинтетическом получении в фармацевтической промышленности товарных форм L-аминокислот для кормового, пищевого или медицинского применения необходимо также использование тонкого органического синтеза на стадиях выделения, концентрирования и очистки субстанций аминокислот. Микробиологическое промышленное производство L-аминокислот можно осуществлять по двум

технологическим схемам. Двухступенчатый способ предполагает образование и подготовку предшественника, а также биосинтез ферментного препарата микробного происхождения, который будет трансформировать предшественник в целевую аминокислоту. Это первая ступень. Вторая ступень — собственно процесс трансформации полученного на 1 стадии предшественника в аминокислоту с помощью ферментных систем микроорганизмов. Таким путем получают, в частности, L-лизин. Одноступенчатый способ синтеза аминокислот с помощью микроорганизмов основан на культивировании строго определенного штамма-продуцента целевой аминокислоты на среде определенного состава при соответствующих параметрах ферментационного процесса. Промышленный штамм должен обладать способностью к сверхсинтезу нужной аминокислоты. Для этой цели выбирают полиауксотрофные мутанты, т.е. те клетки микроорганизмов, которые, с одной стороны, утратили способность самостоятельно синтезировать необходимые для роста и развития клетки различные аминокислоты, а с другой — приобрели способность к сверхсинтезу целевой аминокислоты. Микроорганизмы осуществляют контроль биосинтеза каждой аминокислоты по принципу обратной связи как на уровне генов, ответственных за синтез соответствующих ферментов (репрессия), так и на уровне самих ферментов, способных при избытке аминокислоты изменять свою активность (ретроингибирование), что совершенно исключает перепроизводство аминокислоты клеткой в природных условиях. Из этого следует, что целью биотехнолога является нарушение этих систем регуляции с дальнейшим отбором ауксотрофных мутантов на селективных средах с использованием мутагенов (УФ, рентгеновские лучи, нитрозосоединения и др.). Такие мутанты имеют в геноме дефектный ген, детерминирующий фермент, без которого не может осуществляться биосинтез определенной аминокислоты. Важно, что получение ауксотрофных мутантов-продуцентов аминокислоты возможно только для микроорганизмов с разветвленной цепью биосинтеза, т.е. по крайней мере две аминокислоты должны синтезироваться из одного предшественника. У таких ауксотрофных мутантов избыток одной аминокислоты при дефиците другой не приводит к подавлению активности первого фермента. Однако аминокислота, биосинтез которой нарушен, должна быть добавлена в ограниченном количестве (при синтезе лизина добавляется гомосерин или треонин на 1-й стадии). Продуцент лизина – Corynebacteriumglutamicum (коринебактерии) — имеет единственную р-аспартакиназу (фермент), активность которой регулируется путем согласованного ингибирования по принципу обратной связи. Этот мутантный штамм-продуцент является ауксотрофом по гомосерину и треонину. Для длительной работы ауксотрофных штаммов-продуцентов лизина в питательную среду вносят белковые гидролизаты в режиме дробной подачи (комплекс аминокислот). Для получения L-треонина используют промышленный мутантный штамм Ксоli (энтеробактерии), где система регуляции биосинтеза аминокислоты основана на принципе дифференциальной регуляции изоферментами. Этот штамм — тройной ауксотроф. У него изменен 1 фермент цепи биосинтеза (нечувствительный к треонину), отсутствуют механизмы репрессии («хроническое голодание» по изолейцину), при помощи методов генной инженерии треониновые гены размножены на плазмидах, что значительно увеличило продуктивность штамма. При получении аминокислоты методами прямого микробиологического синтеза применяют полупериодическую ферментацию (регулируемую) с хорошей аэрацией (барботер) и перемешиванием (мешалка).

Задача 16.

Как известно, производство витамина В₁₂ (кобаламин*) является чисто биотехнологическим способом его получения, когда в качестве продуцента данного витамина используют пропионовые бактерии из рода Propionibacterium, выращиваемые на богатой среде в определенных условиях ферментации с обязательным добавлением предшественника витамина В12 — 5, 6-диметилбензимидазола.

В этой ситуации:

· сделайте оптимальный выбор метода ферментации и условий ее проведения;

· докажите необходимость добавления 5,6-диметилбензимидазо-ла в определенное время после начала ферментации и предупредите образование коферментной формы витамина В12;

· предложите методы выделения и очистки данного витамина, учитывая место его накопления.

Ответ:

В настоящее время промышленное производство витамина В12 осуществляют исключительно биотехнологическими методами. Продуцентом витамина В12 являются пропионовые бактерии из рода Propionibacterium. Добавление в среду предшественника витамина В12 — 5, 6-диметилбензимидозола – резко повышает продуктивность продуцента. Повышению продуктивности также способствует и добавка в питательные среды кукурузного и мясного экстракта, соевой муки, рыбной муки. Выращивание пропионовых бактерий производят периодическим методом в анаэробных условиях на среде с кукурузным экстрактом, глюкозой, солями кобальта и сульфатом аммония. Образующиеся в процессе жизнедеятельности бактерий кислоты нейтрализуются щелочью. Через 72 ч после начала ферментации вносят предшественник — 5,6-диметилбензи-мидазол. Длительность ферментации составляет около 3 сут. Если не добавить 5,6-диметилбензимидазола, то вместо витамина В,2 синтезируется фактор В (кобинамид), и не обладающий терапевтическим действием псевдовитамин В12, у которого азотистым основанием служит аденин. Поскольку витамин В12 сохраняется в клетках бактерий, биомассу отделяют сепарированием и извлекают из нее целевой продукт с помощью экстракции подкисленной водой (рН от 4,5 до 5,0) при температуре 85-90 «Св течение часа. Витамин В12 является водорастворимым витамином. Именно поэтому водный раствор стабилизируют NaNO2, получая коферментную форму витамина, которую очищают на ионообменной смоле. Затем следует кристаллизация витамина из водно-ацетонового раствора, химическая очистка и изготовление лекарственных форм из полученного продукта.

Источник

Биотехнология витаминов

Автор работы: Пользователь скрыл имя, 20 Декабря 2013 в 10:19, курсовая работа

Краткое описание

Содержание

Прикрепленные файлы: 1 файл

Курсовая по битехе.doc

Государственное образовательное учреждение

Высшего профессионального образования

«Пермская государственная фармацевтическая академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

Кафедра промышленной технологии с курсом биотехнологии

КУРСОВАЯ РАБОТА ПО БИОТЕХНОЛОГИИ

Выполнила: Скворцова К. М.

Преподаватель: Соснина О. Ю.

Применение их в различных областях.

Биологические технологии (биотехнологии) обеспечивают управляемое получение полезных продуктов для различных сфер человеческой деятельности. Эти технологии базируются на использовании каталитического потенциала различных биологических агентов и систем – микроорганизмов, вирусов, растительных и животных клеток и тканей, а также внеклеточных веществ и компонентов клеток. В настоящее время разработка и освоение биотехнологии занимают важное место в деятельности практически всех стран. Определить сегодня, что же такое биотехнология, весьма не просто. Вместе с тем, само появление этого термина в нашем словаре глубоко символично. Оно отражает мнение, что применение биотехнологических материалов и принципов в ближайшие годы радикально изменит многие отрасли промышленности и само человеческое общество. Интерес к этой науке и темпы ее развития в последние годы растут очень быстро.

Витамины. Применение их в различных областях. Пути производства.

Витамины – это низкомолекулярные органические вещества, необходимые любому организму в ничтожных концентрациях и выполняющих в нём каталитические и регуляторные функции. Недостаток того или иного витамина нарушает обмен веществ и нормальные процессы жизнедеятельности организма, приводя к развитию патологических состояний. Природным источником многих витаминов являются растения и микроорганизмы. Необходимость крупномасштабного производства витаминов определяется широкой областью их применения.

Сельское хозяйство – витаминны е концентраты для повышения прод уктивности животноводства.
Пищевая промышленность – добавки для повышения полноценности продуктов питания.
Здравоохранение и медицина – как лечебно-профилактические средства в индивидуальном виде и в виде комбинированных препаратов.

В настоящее время в производстве многих витаминов ведущие позиции принадлежат химическому синтезу, однако при производстве отдельных витаминов микробный синтез имеет огромное значение, например при производстве кормовых препаратов витаминов. Отдельные витамины, кобаламины, менахиноны продуцируются только микробными клетками. Витамины принимают активное участие во многих процессах метаболизма человека и высших животных (процессы цикла трикарбоновых кислот, распад и синтез жирных кислот, синтез аминокислот и др.), оказывая влияние на разнообразные физиологические процессы.

Микробиологическим путем получают некоторые витамины группы B, а также эргостерин и каротин, являющиеся, соответственно, предшественниками витаминов D2 и провитамина A.

Экстракция витаминных препаратов из растительного или из животного сырья. Именно этим путём были получены первые витаминные препараты. В настоящее время доля витаминов, получаемых этим путём, незначительно в виду малого содержания их в природном сырье.
Химический синтез. Самый распространённый путь получения на данный момент.
Биосинтез витаминов. Витамины, химический синтез которых невозможен в крупномасштабном производстве или нецелесообразен, получают с применением микроорганизмов, способных к сверхсинтезу и накоплению определённых витаминов.

Витамин В12 – (α-5,6-диметилбензимидазол)- цианкобаламин – полимер сложного строения, являющийся гематопоэтическим и ростовым фактором для многих животных и микроорганизмов. Микробиологический синтез является единственным способом получения данного витамина.

Способность к синтезу данного витамина широко распространена среди прокариотических микроорганизмов. Активно продуцируют витамин В12 Propionibacterium, а также Pseudomonas и смешанные культуры матанообразующих бактерий. Получение витамина на основе пропионовокислых бактерий, способных к самостоятельному синтезу аденозилкобаламина 5,6 ДМБ (коэнзима В12), осуществляется в две стадии в двух последовательных аппаратах объемом 500 л при коэффициенте заполнения 0.65–0.70.

Первую стадию культивирования проводят в течение 80 ч и слабом перемешивании в анаэробных условиях до полной утилизации сахара; полученную биомассу центрифугируют. Сгущенную суспензию инкубируют во втором аппарате еще в течение 88 ч, аэрируя культуру воздухом (2 м3/ч). Среда содержит сахара (обычно глюкозу 1–10 %), добавки солей железа, марганца, магния и кобальта (10–100 мг/л), кукурузный экстракт (3–7 %). В качестве источника азота принят (NH4)2SO4. Ферментацию проводят при 30°С, рН стабилизируют на уровне 6.5–7.0 подтитровкой культуры раствором (NH)4OH. На второй стадии происходит образование ДМБ. После завершения ферментации витамин экстрагируют из клеток, нагреванием в течение 10–30 минут при 80–120°С. При последующей обработке горячей клеточной суспензии цианидом происходит образование CN-кобаламина; продукт сорбируют, пропуская раствор через активированный уголь и окислы алюминия; затем элюируют водным спиртом или хлороформом. После выпаривания растворителя получают кристаллический витамин. Выход В12 составляет до 40 мг/л.

Активными продуцентами В12 являются бактерии рода Pseudomonas. Разработаны эффективные технологии на основе термофильных бацилл Bacillus circulans, в течение 18 ч при 65–75°С в нестерильных условиях. Выход витамина составляет от 2.0 до 6.0 мг/л. Бактерии выращивают на богатых средах, приготовленных на основе соевой и рыбной муки, мясного и кукурузного экстракта. Продукция В12 для медицины составляет около 12 т/г; форма выпуска – стерильный раствор CN-В12 на основе 0.95-го раствора NaCl и таблетки витамина в смеси с фолиевой кислотой или другими витаминами. Для нужд животноводства витамин В12 получают на основе смешанной ассоциации термофильных метаногенных бактерий. Ассоциация состоит из 4-х культур, взаимосвязанно расщепляющих органический субстрат до СО2 и СН4: углеводсбраживающих, аммонифицирующих, сульфатвосстанавливающих и собственно метанобразующих бактерий. В качестве субстрата используют декантированную ацетонобутиловую барду, содержащую 2.0–2.5 % сухих веществ. Брожение проходит при 55–57°С в нестерильной культуре в две фазы: на первой образуются жирные кислоты и метан, на второй – метан, углекислота и витамин В12. Длительность процесса в одном аппарате составляет 2.5–3.5 суток, в двух последовательных – 2–2.5 суток. Концентрация витамина в бражке достигает 850 мкг/л. Параллельно в значительных количествах, до 20 м3/м3 образуется газ (65 % метана и 30 % углекислоты). Бражка имеет слабощелочную реакцию. Для стабилизации витамина ее подкисляют соляной или фосфорной кислотой, затем в выпарном аппарате сгущают до 20 % содержания сухих веществ и высушивают в распылительной сушилке. Содержание В12 в сухом препарате – до 100 мкг/г.

Эргостерин – (эргоста-5,7,22-триен-3β-ол) – исходный продукт производства витамина D2 и кормовых препаратов дрожжей, обогащенных этим витамином. Витамин D2 (эргокальциферол) образуется при облучении ультрафиолетом эргостерина, который в значительных количествах синтезируют бурые водоросли, дрожжи, плесневые грибы. Наиболее активные продуценты эргостерина – Saccharomyces, Rhodotoryla, Candida.

В промышленных масштабах эргостерин получают при культивировании дрожжей и мицелиальных грибов на средах с избытком сахаров при дефиците азота, высокой температуре и хорошей аэрации. Более интенсивно эргостерин образуют дрожжи рода Candida на средах с углеводородами. При получении кристаллического препарата витамина D2 культивируют плесневые грибы (Penicillium, Aspergillus). Для получения кормовых препаратов облучают суспензию или сухие дрожжи (Candida). Облучают тонкий слой 5 % суспензии дрожжей ультрафиолетовыми лампами с длиной волны 280–300 нм. Кормовые препараты дрожжей содержат в 1 г АСВ 5000 Е витамина D2 и не менее 46 % сырого белка. Для получения кристаллического препарата витамина дрожжи или грибной мицелий подвергают кислотному гидролизу при 110°С. Витамин экстрагируют спиртом, фильтруют, далее фильтрат упаривают, несколько раз промывают спиртом. Спиртовый экстракт сгущают до 50 % концентрации сухих веществ, омыляют щелочью. Полученные кристаллы витамина очищают перекристаллизацией и сушат в эфире, отгоняя последний. Кристаллический осадок растворяют в масле. Данный препарат используют в медицинских целях. Эргостерин является также исходным продуктом для получения ряда стероидных гормонов, пищевых и лекарственных препаратов.

Каротиноиды — это изопреноидные соединения, синтезирующиеся многими пигментными микроорганизмами из рода Aleuria, Blakesloa, Corynebacterium, Flexibacter, Fusarium, Halobacterium, Phycomyces, Pseudornonas, Rhodotorula, Saicina, Sporobolomyces и др. Всего описано около 500 каротиноидов.

Из одной молекулы β-каротина при гидролизе образуются две молекулы витамина А,. Это имеет место, например, в кишечнике человека.

Каротиноиды локализуются в виде сложных эфиров и гликозидов в клеточной мембране микроорганизмов, либо в свободном состоянии — в липидных гранулах в цитоплазме. Каротиноид «ретиналь», например, у галофильного вида — Halobacterium halobium — соединен с белком через остаток лизина (опсиноподобный белок); оп участвует в синтезе АТФ благодаря генерации трансмембранного потенциала. В целом, основная функция каротиноидов — защитная. Их биосинтезу в клетках способствует свет.

В качестве продуцентов каротиноидов можно использовать бактерии, дрожжи, мицелиальные грибы. Более часто применяют зигомицеты Blakeslea trispora и Choanephora conjuncta. Спаривающиеся (+) и (-) особи этих видов при совместном культивировании могут образовать 3-4 г каротина на 1 л среды.

Питательные среды для них достаточно сложные и включают источники углерода, азота, витаминов, микроэлемент ов, специальных стимуляторов (гидрол, кукурузно-соевая мука, растительные масла, керосин, р-ионон или изопреновые димеры, и пр.). Стимуляторы целесообразно вносить в культуральные среды в конце трофофазы, то есть когда продуцент переходит в продуктивную фазу (идиофазу).

Вначале штаммы выращивают раздельно, а затем — совместно при 26°С и усиленной аэрации с последующим переносом в основной ферментатор. Условия культивирования сохраняют прежними. Длительность ферментации — 6-7 дней. Каротиноиды извлекают ацетоном (можно каким-либо другим полярным растворителем), переводят в неполярный растворитель. В случаях извлечения белково-каротиноидных комплексов, то применяют поверхностно-активные вещества в концентрации 1—2%. В целях очистки и более тонкого разделения гомологов можно прибегать к методам хроматографии или к смене растворителей. Витамин A1 из β-каротина сравнительно легко можно получить при гидролизе. В случае изготовления каротинсодержашей биомассы для скармливания животным и птицам возможно ее сочетанное применение с витамином А или без него. В медицинских целях витамин А изготавливают в капсулах для приема через рот.

Аскорбиновая кислота, или витамин С — это противоцинготный витамин, имеющийся у всех высших растений и животных; только человек и микробы не синтезируют ее, но людям она неотложно необходима, а микробы не нуждаются в ней. И, тем не менее, определенные виды уксуснокислых бактерий причастны к биосинтезу полупродукта этой кислоты — L-сорбозы. Таким образом, весь процесс получения аскорбиновой кислоты является смешанным, то есть химико-ферментативным.

Биологическая стадия процесса катализируется мембраносвязанной полиолдегидрогеназой, а последняя (химическая) включает последовательно следующие этапы; конденсация сорбозы с диацетоном и получение диацетон — L-сорбозы, окисление диацетон — L-сорбозы до диацетон-2-кето-1,-гулоновой кислоты, подвергаемой затем гидролизу с получением 2-кето-Ь-гулоновой кислоты; последнюю подвергают энолизации с последующей трасформацией в L-аскорбиновую кислоту.

Источник